三峽庫區栽培重樓屬藥用植物中薯蕷皂苷元含量測定

張靜 丁博 祁俊生 陳秀紅 周濃

摘要：目的 建立高效液相色譜法測定重樓中薯蕷皂苷元含量，考察不同產地和不同品種重樓屬藥用植物中薯蕷皂苷元的含量。方法 采用島津Inertsil ODS-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 ?m），以乙腈-水（92∶8）為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長203 nm，柱溫30 ℃。結果 不同產地、不同品種的重樓屬藥材中均含有薯蕷皂苷元，渝北區的長藥隔重樓含量最高（6.813 7 mg/g），城口縣的狹葉重樓含量次之（5.758 4 mg/g），最低的為石柱縣的滇重樓（1.952 2 mg/g），表明不同栽培品種重樓藥材化學品質差異較大，可能與產地、品種及栽培技術等因素有關。結論 非藥典品種長藥隔重樓、狹葉重樓含量超過中國藥典收載品種，具有較大的藥用價值。

關鍵詞：重樓；薯蕷皂苷元；高效液相色譜法；質量評價

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.021

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）06-0080-04

Abstract： Objective To establish an HPLC method to determine the content of diosgenin in Paridis Rhizoma； To examine contents of diosgenin in different varieties of Paridis Rhizoma medicinal plants and from different habitats. Methods Shimadzu Inertsil ODS-C18 guard column （150 mm×4.6 mm， 5?m） was used in HPLC system； elution conditions were the mobile phase using 92% acetonitrile and 8% water （isocraticelution） at a flow rate of 1.0 mL/min with 203 nm detection wavelength. The temperature of the column oven was maintained at 30 ℃. Results Different varieties of Paridis Rhizoma medicinal plants and Paridis Rhizoma medicinal plants from different habitats contained diosgenin. The Paris polyphylla var. pseudothibetica in Yubei district had the highest content （6.813 7 mg/g）； Paris polyphylla var. stenophylla in Chengkou County had the middle content （5.758 4 mg/g）； Paris yunnanensis Franch in Shizhu county showed the lowest content （1.952 2 mg/g）. The results showed that the obvious difference of chemical quality between various cultivated varieties of Paridis Rhizoma medicinal plants， which might be related with origin， variety and the cultivation technology， and so on. Conclusion The diosgenin contents of Paris polyphylla var. pseudothibetica and Paris polyphylla var. stenophylla were higher than that of varieties recorded in Chinese Pharmacopeia. Paris polyphylla var. pseudothibetica and Paris polyphylla var. stenophylla had important medical value.

Key words： Paridis Rhizoma； diosgenin； HPLC； quality evaluation

重樓主要活性成分為薯蕷皂苷和偏諾皂苷等類型，薯蕷皂苷通過水解可以得到薯蕷皂苷元[1-2]。薯蕷皂苷元是合成甾體激素類藥物的重要原料，具有抗腫瘤、抗炎、心血管保護、免疫調節、抗氧化等多種生物活性，為重樓藥材生物活性的物質基礎[3]。三峽地區為重樓屬藥用植物的地理分布中心之一，藥材品種較為豐富[4-5]，但存在種質來源復雜、分類不明等嚴重問題，導致其開發利用率較低。目前，已有對滇重樓[6]、七葉一枝花[7]、北重樓[8]等重樓藥材中薯蕷皂苷元含量測定的報道。本試驗采用高效液相色譜法（HPLC）測定重樓藥材中薯蕷皂苷元含量，并對比三峽庫區不同產地、不同品種重樓藥材質量，以期為三峽庫區重樓藥材資源的合理開發與利用提供參考。

1 儀器與試藥

LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司），DZF-6050MBE型電熱恒溫真空干燥箱（上海博訊實業有限公司），RV 10 basic V型旋轉蒸發儀（德國IKA集團），CP225D型分析天平（德國Sartorius公司）。

重樓新鮮根莖采自重慶市開縣滿月鄉雙坪村1組等地，每份樣品均取10株成熟植株根莖以保證樣品代表性，并由中國科學院昆明植物研究所李恒研究員鑒定（見表1）。薯蕷皂苷元對照品（批號111539- 200001，中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用）。色譜純乙腈為德國默克公司，其他試劑均為國產分析純，水為娃哈哈牌純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

島津Inertsil ODS-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 ?m），流動相為乙腈-水（92∶8），流速為1.0 mL/min，檢測波長為203 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為20 ?L，采集時間10 min，理論板數以薯蕷皂苷元峰面積計不得低于4000。色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液的制備

取薯蕷皂苷元對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.539 0 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

參照周氏等[6]方法略作修改。精密稱取本品粉末（過三號篩）約0.20 g，置250 mL具塞三角瓶中，加入石油醚（60～90 ℃）50 mL，超聲提取（300 W，40 kHz）2 h，棄石油醚，殘渣加入甲醇25 mL，超聲提取（300 W，40 kHz）40 min，放冷，過濾，重復操作1次，合并濾液，減壓回收甲醇至干，加2 mol/L鹽酸10 mL，置沸水浴中水解2.5 h，放冷，置分液漏斗中，加入石油醚（60～90 ℃）萃取3次，每次30 mL，合并石油醚萃取液，水洗至中性，減壓回收石油醚至干，殘渣用甲醇溶解并轉移至10 mL量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得。

2.4 線性關系考察

精密吸取對照品貯備溶液，采用逐級稀釋法分別制得薯蕷皂苷元的0.027 0、0.053 9、0.134 8、0.269 5、0.404 3、0.539 0 mg/mL對照品標準液。分別精密吸取對照品標準液20 μL，注入液相色譜儀，得進樣量（μg）與峰面積的線性方程。結果表明，薯蕷皂苷元在0.54～10.78 μg線性范圍內其進樣量與峰面積具有良好的線性關系，回歸方程為Y=631 205X+52 970，r=0.999 8（n=6）。

2.5 精密度試驗

取同一供試品溶液（S3），按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，測得薯蕷皂苷元峰面積的RSD=0.35 %，表明儀器進樣精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取同一供試品溶液（S3），室溫密閉放置，按“2.1”項下色譜條件在0～24 h每隔4 h測定1次，結果薯蕷皂苷元峰面積RSD=1.89%，表明樣品溶液在24 h內穩定。

2.7 重復性試驗

取同一重樓樣品6份（S3），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，結果薯蕷皂苷元的平均含量為2.539 5mg/g，RSD=1.61%，表明本方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

稱取已知含量的重樓藥材粉末約0.10 g（S3），共6份，分別精密加入薯蕷皂苷元對照品適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率，結果表明，薯蕷皂苷元平均回收率為96.81%，RSD=1.48%，符合分析要求（見表2）。

2.9 樣品測定

分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，進樣前過0.22 ?m微孔濾膜，進樣20 ?L，進行HPLC分析，測定峰面積，以外標兩點法計算各重樓中薯蕷皂苷元的含量，結果見表3。

3 討論

對不同流動相體系、檢測波長和供試品溶液的制備方法[6-8]進行了綜合考察，結果表明，以乙腈-水（92∶8）的流動相體系等度洗脫所得色譜峰分離效果最佳；檢測波長在203 nm處薯蕷皂苷元有最大吸收；甲醇為提取溶劑，超聲提取40 min，超聲提取2次，酸水解、有機溶劑萃取即可將重樓中的薯蕷皂苷元基本提取完全。

本研究結果表明，三峽庫區不同產地的重樓藥材普遍含有薯蕷皂苷元，但同一品種的不同產地重樓藥材中薯蕷皂苷元含量存在較大差異，其中以重慶市城口縣與重慶市石柱縣產狹葉重樓中薯蕷皂苷元含量相差近2倍，重慶石柱縣與重慶市萬州區產滇重樓中薯蕷皂苷元含量也相差近2倍，但3個不同產地的七葉一枝花含量相差甚微，與付氏等[11]報道類似。造成三峽庫區不同產地重樓薯蕷皂苷元含量差異的原因，可能與栽培技術、產地環境等有關[9-11]，表明需加大對重樓的人工栽培技術和產地適宜性研究，以確保重樓藥材資源可持續利用和重樓醫藥產業可持續發展。

除2個中國藥典法定品種（七葉一枝花和滇重樓）外，筆者還采集到其他5個種/變種，試驗結果表明，重樓屬不同種植物的薯蕷皂苷元含量存在較大差異（1.952 2～6.813 7 mg/g），渝北區的長藥隔重樓含量最高，城口縣的狹葉重樓含量次之，最低的為石柱縣的滇重樓。不同品種間薯蕷皂苷元含量差異較大，非藥典品種能否代替重樓入藥有待進一步深入研究。

前期研究表明，重樓屬植物大部分品種均在入藥，且部分品種與中國藥典收載品種（滇重樓和七葉一枝花）具有一定的化學成分等同性[4，11-12]。本試驗結果進一步表明，不同品種重樓藥材中薯蕷皂苷元含量差別很大，而民間有代用的習慣，因此制定其含量標準是很有科學意義的。

致謝：中國科學院昆明植物研究所李恒研究員在植物標本鑒定中給予的幫助。

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（收稿日期：2015-07-02）

（修回日期：2015-07-21；編輯：陳靜）