基于血液微透析技術探究五味子甲素的體內代謝過程

諸明娜 徐瑞鑫

摘要：目的 建立高效液相色譜法測定大鼠血漿中五味子甲素的方法，探討五味子甲素在大鼠血中的代謝過程。方法 采用血液微透析技術，將探針由右側頸靜脈植入大鼠右心房膨大處，透析取樣。透析液檢測的色譜條件為：以甲醇-乙腈-水（40∶35∶25）為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，UV檢測波長254 nm。經體內測定探針的回收率校正后，繪制藥時曲線，采用DAS2.0軟件計算五味子甲素灌胃給藥后在大鼠血液中的藥動學參數。結果 五味子甲素在2～500 μg/mL濃度范圍內線性關系良好（r=0.999 5），日內精密度和日間精密度均RSD<3%，五味子甲素的含藥透析液室溫放置12 h內穩定性良好。藥動學參數ke為（0.364±0.047）/h，t1/2為（1.637±0.302）h，Tmax為（0.612±0.194）h，Cmax為（165.92±28.830）μg/mL，AUC0-t為（240.793±25.540）μg·h/mL，AUC0-∞為（282.710±30.727）μg·h/mL。結論 本方法操作便捷、液相保留時間短，能滿足透析液中五味子甲素含量測定的需要，可用于五味子甲素在大鼠血液中代謝過程的研究。

關鍵詞：血液微透析；五味子甲素；高效液相色譜法；藥時曲線

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.025

中圖分類號：R284 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）06-0099-04

Abstract： Objective To establish an HPLC method for evaluating deoxyschizandrin in rat plasma； To explore deoxyschizandrin metabolic processes in blood. Methods The blood microdialysis probe was implanted into the right atrial enlargement through right jugular vein to detect the concentration of deoxyschizandrin in blood. Chromatographic conditions for detecting of dialysis fluid were as follows： mobile phase was methanol-acetonitrile- water （40：35：25）； flow rate was 1 mL/min； column temperature was 30 ℃； UV detection wavelength was 254 nm. The data obtained after being calculated by the recovery rate of the probe in vivo were dealt with DAS 2.0 software. Pharmacokinetic parameters were calculated， and the concentration-time related curves were plotted. Results The deoxyschizandrin curve was linear （r=0.999 5） within the range of 2–500 μg/mL. The RSD of intra-day pecision and inter-day pecision were both <3%. The stability of the solution was good in 12 hours at roomtemperature. ke was （0.364±0.047）/h； t1/2 was （1.637±0.302）h； Tmax was （0.612±0.194）h； Cmax was （165.92±28.830） μg/mL； AUC0-t was （240.793±25.540） μg·h/mL； AUC0-∞ was （282.710±30.727） μg·h/mL. Conclusion The method is convenient to perform， and the retention time of HPLC is short. This method is suitable for detecting the content of deoxyschizandrin in dialysis fluid， which can also be used to investigate the metabolic processes of deoxyschizandrin in the rat blood.

Key words： microdialysis； deoxyschizandrin； HPLC； concentration-time curve

微透析技術是近年來發展起來的一種新型的生物在體采樣技術，在組織或者血管中植入具有半透膜的探針，小分子物質可以隨著濃度梯度通過半透膜，而分子量較大的物質如蛋白等則不能自由通過半透膜。采用微量灌流泵使一定量的灌流液流經探針，即可在收集裝置中定量檢測所測物質的含量。微透析技術最早用于測定實驗動物腦內神經遞質的含量[1]，目前，該技術已成為研究各種動物腦內神經遞質變化所不可缺少的方法之一。由于微透析技術可從實驗動物血液中連續動態取樣，而且所采集的樣本都是小分子物質，無需除去血清中蛋白的純化過程，可以直接采用高效液相色譜法（HPLC）進行檢測，大大提高了實驗操作的便利性[2]，因此近年來其在藥動學領域的應用越來越廣泛[3-4]。

五味子是多年生木蘭科植物，具有收斂固澀、補腎寧心、益氣生津的功效。現代藥理學研究表明，五味子可作用于機體多個系統，如中樞神經系統、心血管系統和免疫系統等[5]，尤其是在保護肝損傷[6]和抗氧化[7]方面具有非常顯著的療效。五味子甲素是中藥五味子中的木脂素類成分之一，具有誘導肝微粒體細胞色素P450酶活性進而增強肝臟的解毒功能、降低血清轉氨酶、阻斷多種毒性物質對肝細胞膜的損傷等作用。中藥的藥效物質基礎研究是中藥現代化的重點和核心內容，本研究采用微透析技術對五味子中主要藥效成分之一五味子甲素在大鼠體內的代謝過程進行研究，以期初步闡明五味子甲素在血液中的代謝特點，為五味子制劑在臨床的更廣泛應用提供依據。

1 儀器、試藥與動物

e2695高效液相色譜儀（Waters公司），2998UV二極管陣列檢測器，kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，大連依利特分析儀器有限公司），CMA402透析液灌流泵（瑞典CMA公司），微透析探針（shaft：5 cm，cut off：15 kD，瑞典MAB公司）。

五味子甲素，成都科普生物有限公司，HPLC測定純度>98%，批號110857-201311。吐溫-80，化學純，天津市東麗區天大化學試劑廠；甲醇，HPLC級，美國迪馬試劑公司；氯化鈉，分析純，天津市紅巖化學試劑廠；氯化鉀，分析純，天津市東麗區天大化學試劑廠；硫酸鎂，分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司；純凈水，Millipore water purification systems 制備；氯化鈣，分析純，天津市基準化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀，分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司；碳酸氫鈉，分析純，齊齊哈爾市華僑化工廠。

清潔級雄性Wistar大鼠6只，體質量（250±20）g，購自南京醫科大學動物實驗中心，許可證號SYXK（蘇）2002-0013。實驗前在本實驗室條件下單籠飼養1周，以適應環境，減少應激對實驗結果的影響，溫度20～22 ℃，相對濕度45%～65%。

2 方法與結果

2.1 微透析取樣方法的建立

2.1.1 透析液的配制 采用Ringer's Solution作為透析液[8]，包括0.4 mmol/L KH2PO4、3.0 mmol/L KCl、25.0 mmol/L NaHCO3、1.2 mmol/L CaCl、1.2 mmol/L MgSO4、122.0 mmol/L NaCl，另加入1%吐溫-80，混懸后超聲震蕩20 min使其形成均一穩定的溶液。透析液均為每次使用前現配。

2.1.2 微透析探針的植入 10%烏拉坦溶液（10 mL/kg）麻醉大鼠，仰位固定于手術臺上，剪開頸部皮毛，鈍性剝離右側頸靜脈，遠心端結扎，采用眼科剪刀在靜脈血管處開一小口，將含有保護套管的微透析探針經由頸靜脈植入大鼠右心房膨大處[9]（上腔靜脈與下腔靜脈匯合位置，距離頸外靜脈和頸內靜脈匯合處約3.3～3.5 cm），用非吸附性手術線固定，防止探針脫位。整個植入過程中用吐溫-80潤滑保護套管，以保證探針順利植入。

2.2 五味子甲素測定方法

2.2.1 色譜條件 參考文獻[10-12]中五味子甲素的HPLC檢測方法，并結合本試驗中透析液的特性，對檢測條件進行適當優化。最終確定色譜條件如下：流動相為甲醇-乙腈-水（40∶35∶25），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，UV檢測波長254 nm。

2.2.2 對照品儲備液的制備 精密稱取五味子甲素對照品1.0 mg，溶解在2 mL透析液中，配制成濃度為0.5 mg/mL的對照品儲備液。

2.2.3 專屬性考察 分別進樣五味子甲素對照品儲備液、空白透析液和大鼠給藥后血液透析液各10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進行檢測，考察該色譜條件的專屬性。五味子甲素對照品、空白透析液和大鼠給藥后血液透析液的高效液相色譜圖見圖1，五味子甲素的保留時間約為9.8 min，五味子甲素峰與周圍雜質峰能夠達到基線分離，且峰形良好，透析液中其他成分對信號峰無干擾。

2.2.4 標準曲線的制備 取對照品儲備液適量用空白透析液進行梯度稀釋，得到系列濃度梯度的對照品透析液，即500、200、100、20、2 μg/mL。按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，進樣量為10 μL，以峰面積對五味子甲素濃度做線性回歸，制備標準曲線，回歸方程為Y=4781.0X+18 697.1，r=0.999 5，表明五味子甲素在2～500 μg/mL濃度范圍內線性關系良好。

2.2.5 日內精密度和日間精密度考察 取濃度分別為500、200、20 μg/mL的五味子甲素透析液，按“2.2.1”項下色譜條件在同日內連續5次進樣分析，進樣量為10 μL，分別測定3個濃度的日內精密度。將上述3個濃度的五味子甲素透析液連續5 d重復進樣檢測，進樣量為10 μL，測定日間精密度。結果見表1。結果表明，無論日內精密度還是日間精密度，500、200、20 μg/mL五味子甲素峰面積RSD值均在0.58%～2.89%之間，符合定量檢測的要求。

2.2.6 穩定性試驗 取濃度分別為500、200、20 μg/mL的五味子甲素透析液，室溫放置，按“2.2.1”項下色譜條件分別于2、4、6、8、12 h進樣分析，進樣量為10 μL，記錄峰面積。結果表明500、200、20 μg/mL五味子甲素峰面積RSD值分別為0.62%、0.82%、1.34%，符合定量檢測的要求，表明五味子甲素透析液室溫放置12 h內穩定性良好。

2.3 五味子甲素藥動學研究

2.3.1 樣品采集與測定 打開透析液灌流泵（流速2 μL/min），用空白透析液灌流1 h后，灌胃給藥五味子甲素20 mg/kg，灌胃后立即開啟透析液自動收集裝置，樣品采集點分別為第5、15、25、35、45、55、65、75、85、95、115、135、155、185、215、245 min，共連續收集16個樣品。所得透析液樣品按“2.2.1”項下色譜條件立即進樣分析，進樣量為10 μL，記錄峰面積。

2.3.2 體內回收率測定 收集樣品后，用空白透析液繼續灌流2 h，然后換用已知濃度的五味子甲素透析液（濃度100 μg/mL）繼續灌流，平衡1 h后，收集連續3個樣品，收集間隔為10 min。收集樣品按“2.2.1”項下色譜條件立即進樣分析，進樣量為10 μL，記錄峰面積，測定探針在大鼠體內的回收率（R），計算公式R=（1-Cout/Cin）×100%[13]。個體血藥濃度均經自身的體內回收率進行校正。個體實驗結束后，處死大鼠，開胸檢查探針半透膜植入的位置，位置不正確的個體數據不納入統計。

2.3.3 藥動學參數的計算 運用DAS2.0藥動學軟件進行統計分析，采用統計矩的方法計算各藥動學參數，并以血藥濃度對時間做藥時曲線，結果見圖2、表2。

3 討論

血液微透析技術可在同一實驗動物的不同組織中植入探針，進而同時連續動態地監測藥物在多個組織的代謝過程，既降低了實驗誤差，又減少了實驗動物的樣本數。與傳統的采靜脈血測定方法相比，血液微透析的在體取樣技術不減少動物體液含量，而且透過透析膜的小分子物質可直接進行液相檢測，所測血藥濃度更加準確。另外，采得的樣本都是游離態藥物，相對來說能更加準確反映有效成分的藥物濃度[14]。

有研究表明，雄性大鼠細胞色素P3A1、P3A2、P3A18在微粒體內的含量分別為雌性大鼠的5、10、20倍以上，另外，雄性大鼠細胞色素P450酶的含量也較雌性大鼠高10%～30%[15]，這也解釋了與五味子甲素同為木脂素類成分的五味子醇甲在雌性大鼠體內代謝相對較慢的現象。為最大程度上減少實驗動物性別因素對結果的影響，本研究全部采用Wistar品系雄性大鼠。

探針的植入位置對實驗結果的影響較大[16]。在本研究的預實驗中，曾考察過其他植入位置，如大鼠的頸靜脈，但此處空間狹小且血流速度較慢，探針植入后阻礙頸靜脈血液回流，并且極易造成凝血，致使探針透析膜堵塞。最終選用大鼠上下腔靜脈匯合處作為探針植入處，此處接近大鼠的右心房，空間較大，將探針植入此處，雖然阻礙了一小部分上腔靜脈血液的回流，但下腔靜脈會提供充足的血流供透析采樣。經過反復預試驗的摸索，最后確定采用體質量250 g左右的大鼠、探針由頸靜脈植入的深度在3.3～3.5 cm之間較為合適。

常用的測定微透析探針回收率的方法主要有體外測定和體內測定2種[17-18]。由于體內測定的環境、溫度、pH值和血流速度等都與探針實際透析時一致，測定結果更加準確、客觀。因此，本研究采用體內減量法測定探針的回收率。

本研究考察的是大鼠灌胃給藥五味子甲素后在體內的代謝過程，在預實驗中沒有考察五味子甲素在大鼠體內是否符合線性藥動學的特征，在藥動學參數的計算過程中采用房室模型擬合是不合理的，因此，本研究采用統計矩的方法計算相關的藥動學參數，該方法主要通過藥時曲線下面積分析藥物在體內的代謝過程，不受限于數學模型，適用于任何隔室模型，是非隔室分析法之一[19]。

五味子甲素在大鼠體內的藥時曲線表明，大鼠灌胃五味子甲素后血藥濃度迅速升高，約35 min后血藥濃度達到峰值（165 μg/mL左右），隨后迅速下降。由藥動學參數可以看出，五味子甲素在大鼠體內的半衰期和滯留時間均較短，屬于快速代謝型藥物，這與以往文獻報道的結果相似[20]。

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（收稿日期：2015-07-10）

（修回日期：2015-08-03；編輯：陳靜）