丹參酮ⅡA通過調節miR-133水平對慢性心力衰竭心肌重構的影響

馮　俊，陳華文

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院，湖北 武漢 430030)

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丹參酮ⅡA通過調節miR-133水平對慢性心力衰竭心肌重構的影響

馮俊，陳華文

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院，湖北 武漢 430030)

[摘要]目的探討丹參酮ⅡA是否能通過調控miR-133水平影響慢性心力衰竭大鼠心肌重構。方法將SD大鼠隨機分為假手術組、手術組、丹參酮ⅡA組、 miR-133抑制劑組，每組10只。除假手術組外，其余組大鼠均行腹主動脈縮窄術建立心力衰竭模型。各組均正常喂養4周后，丹參酮ⅡA組和miR-133抑制劑組均給予丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液灌胃，miR-133抑制劑組同時皮下植入滲透泵持續泵入miR-133拮抗劑antagomirs，假手術組、手術組給予等容積生理鹽水灌胃，均連續12周。末次灌胃后24 h檢測各組大鼠心功能，取心臟計算心臟指數及左心室質量指數，HE染色觀察大鼠心肌形態學變化，Masson染色觀察大鼠心室肌膠原變化。結果與假手術組比較，手術組心功能惡化(P<0.05)，心臟指數及左心室質量指數、心肌細胞直徑和膠原含量增加(P均<0.05)；丹參酮ⅡA組和miR-133 抑制劑處理組上述各指標均較手術組明顯改善(P均<0.05)，但丹參酮ⅡA組上述各指標改善情況均明顯優于miR-133抑制劑處理組(P均<0.05)。結論miR-133在丹參酮ⅡA抗心力衰竭大鼠左心室重構中發揮著重要作用，丹參酮ⅡA可能通過上調miR-133水平發揮抗心力衰竭心肌重構的作用。

[關鍵詞]丹參酮ⅡA；miR-133；心力衰竭；心肌重構

心力衰竭是各種心臟疾病的嚴重階段，而心室肌重構是心力衰竭的獨立危險因素，隨著心室肌組織重構的發生及發展，可導致心肌組織缺氧缺血狀態的逐漸加重，從而引起心室順應性的下降，最終導致心肌缺血、心律失常和猝死[1]。因此防治和逆轉心肌重構是治療心力衰竭的重點。相關研究發現，我國傳統中藥丹參的主要成分丹參酮ⅡA具有抗缺氧缺血、改善微循環、抑制血小板黏附聚集等保護心血管作用，因此廣泛應用于臨床[2-4]；筆者的前期研究已經發現，丹參酮ⅡA可以升高心力衰竭大鼠下降的miR-133 mRNA水平[5]。本實驗研究在前期研究的基礎上觀察了丹參酮ⅡA能否通過調控miR-133水平影響心力衰竭大鼠整體心肌結構重構，現將結果報道如下。

1實驗資料

1.1實驗動物健康成年雄性SD大鼠40只，月齡2個月，體質量250～300 g，同濟醫學院動物實驗中心提供，動物合格證號：SCXK鄂2009-0003。

1.2藥物及試劑丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(上海第一生化藥業有限公司產品),miR-133拮抗劑antagomirs[寶生物(大連)有限公司]，其余試劑為國產分析純，武漢康盛醫藥科技有限公司產品。

1.3實驗方法將SD大鼠隨機分為假手術組、手術組、丹參酮ⅡA組、miR-133抑制劑組，每組10只，4組大鼠均于同一環境下飼養。除假手術組外，其余組大鼠均采用腹主動脈縮窄法(AAC)構建慢性心力衰竭大鼠模型:10%水合氯醛(0.3 mL/kg)腹腔麻醉，仰位固定，腹部常規備毛、消毒，于腹中線開腹處理，暴露分離腹主動脈，8號針頭平行置于腹主動脈旁后采用手術縫線(4/0)將兩者結扎，隨后抽出針頭關閉腹腔。術后腹腔注射青霉素抗感染。假手術組只分離腹主動脈，不結扎。各組均正常喂養4周。從第5周開始，丹參酮ⅡA組和miR-133抑制劑處理組均給予丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液1 mL/(kg·d)灌胃，miR-133拮抗劑組同時皮下植入滲透泵持續泵入miR-133拮抗劑antagomirs(0.6 μmol/L)，假手術組、手術組給予等容積生理鹽水灌胃，均連續12周。

1.4觀察指標

1.4.1心功能末次灌胃后24 h,10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠， 仰臥固定四肢，胸前區剃毛，使用GEViVid 7彩色超聲顯像儀檢測心功能指標舒張末期左室后壁厚度(LVPWTd)、收縮末期左室后壁厚度(LVPWTs)、舒張末期室間隔厚度(IVSTd)、收縮末期室間隔厚度(IVSTs)、舒張末期左室內徑(LVEDD)、收縮末期左室內徑(LVESD)、左室射血分數(LVEF)、左室短軸縮短率(FS)。

1.4.2心臟指數(HWI)及左心室質量指數(LVMI)各組大鼠靜脈注射過量的氯化鉀(可使心臟止于收縮期)后迅速取出心臟稱質量，并分離大血管、心房及右心室，用預冷的PBS液充分沖洗，濾紙吸干，稱量左心室(包括室間隔)的濕質量，以心臟(mg)與體質量(g)之比作為HWI，左室質量(mg)與體質量(g)之比作為LVMI。

1.4.3心肌形態學變化情況將大鼠心臟用4%甲醛固定，梯度乙醇脫水后，取心尖部組織進行石蠟包埋和切片(5 μm)，行HE染色，觀察心肌組織結構形態學變化。

1.4.4心室肌膠原變化情況將左心室中部冠狀切面的心肌組織用4%多聚甲醛固定后制備成石蠟包埋切片(5 μm)，脫蠟至水，按照Masson試劑盒指示方法進行染色，膠原纖維呈藍色，心肌纖維呈紅色，胞核呈黑藍色。觀察心肌膠原纖維含量變化。

2結果

2.1各組超聲心動圖指標比較手術組LVPWTd、LVPWTs、IVSTs、IVSTd 、LVEDD、LVESD均顯著高于假手術組(P均<0.05)，LVEF、FS均顯著低于假手術組(P均<0.05)；丹參酮ⅡA組和miR-133抑制劑組LVPWTd、LVPWTs、IVSTs、IVSTd 、LVEDD、LVESD均顯著低于手術組(P均<0.05)，LVEF、FS均顯著高于手術組(P均<0.05)；但miR-133抑制劑組LVPWTd、LVPWTs、IVSTs、IVSTd、LVEDD、LVESD均顯著高于丹參酮ⅡA組(P均<0.05)，LVEF、FS均顯著低于丹參酮ⅡA組(P均<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠超聲心動圖檢測結果比較±s)

注：①與假手術組比較，P<0.05；②與手術組比較，P<0.05；③與丹參酮ⅡA組比較，P<0.05。

2.2各組HWI和LVWI比較手術組HWI和LVMI均顯著高于假手術組(P均<0.05)。丹參酮ⅡA組和miR-133抑制劑處理組HWI和LVMI均明顯低于手術組(P均<0.05)，而miR-133抑制劑處理組HWI和LVMI均明顯高于丹參酮ⅡA組(P均<0.05)。見表2。

2.3各組心肌形態學HE染色表現假手術組鏡下見心肌纖維排列正常，無血管擴張及血管壁增厚等表現；手術組心肌細胞直徑增大，細胞排列不整齊，著色不勻，肌纖維束較寬大，肌纖維間疏松水腫，間隙增寬，部分肌束間纖維結締組織增生，血管周圍膠原纖維增生更為明顯，間質中還可見炎癥細胞浸潤等改變；丹參酮ⅡA組心肌肥大、細胞核增大、心肌膠原纖維增生程度較手術組明顯改善，而miR-133抑制劑組上述病理改變較丹參酮ⅡA組明顯。見圖1～4。

2.4各組心肌膠原Masson染色表現正常心肌細胞呈紅色，膠原呈綠色。假手術組心肌間隙可見少量膠原纖維，排列整齊；手術組大鼠心肌間隙見大量膠原堆積，并有微瘢痕形成，心肌纖維排列紊亂，間質膠原纖維增生，以血管周圍為明顯，非血管區膠原纖維增生程度比血管周圍輕；丹參酮ⅡA組可見不同程度膠原沉積于細胞間質，膠原纖維排列紊亂，間質纖維增生，以血管周圍為明顯，但總體膠原纖維增生程度較手術組明顯減輕；miR-133 抑制劑處理組膠原纖維增生程度較丹參酮ⅡA組明顯。見圖5～8。

表2　各組大鼠HWI和LVWI比較

注：①與假手術組比較，P<0.05；②與手術組比較，P<0.05；③與丹參酮ⅡA組比較，P<0.05。

圖1　假手術組大鼠心肌HE染色表現

圖2　手術組大鼠心肌HE染色表現

圖3　丹參酮ⅡA組大鼠心肌HE染色表現

圖4　miR-133抑制劑組大鼠心肌HE染色表現

3討論

圖5　假手術組大鼠心肌膠原Masson染色表現

圖6　手術組大鼠心肌心肌膠原Masson染色表現

圖7　參酮ⅡA組大鼠心肌心肌膠原Masson染色表現

圖8　miR-133抑制劑組大鼠心肌心肌膠原Masson染色表現

近年來，心血管疾病越來越成為危害人類健康的殺手之一，尤其是心肌梗死和心力衰竭。研究表明，左心室重構是心力衰竭發生、發展的基本機制，是心功能由代償期向失代償期轉變的關鍵[6]。預防和抑制心室重構的發生和發展是目前治療心力衰竭的重點方向，找到一個有效物質來阻止和減緩心力衰竭的發生就變得尤其重要，也是改善預后的主要措施。

丹參酮ⅡA是中藥丹參根的乙醚提取物中的脂溶性有效成分，其具有防止過氧化氫對血管內皮細胞造成損傷的作用[7]，而且具有改善心肌缺血、抗急性缺氧、抗心肌肥厚、逆轉左心室重構的作用，可以降低惡性心律失常的發生率[8]。目前研究已證明丹參酮ⅡA能治療各種原因導致的慢性心力衰竭，能明顯改善心功能[9-10]。

本實驗用AAC法建立慢性心力衰竭大鼠模型，發現手術組術后心肌細胞肥大，細胞核增大深染，心肌纖維增生伴炎癥細胞浸潤；Masson染色顯示大量心肌膠原沉積，間質膠原纖維增生。給予丹參酮ⅡA處理后，大鼠心功能、心肌形態學以及心肌膠原含量明顯改善，提示丹參酮ⅡA可抑制和逆緩左心室重構。此外，本研究為證明丹參酮ⅡA是否通過調控miR-133來抑制心力衰竭大鼠左心室重構，設立了miR-133抑制劑組，即在給予AAC大鼠丹參酮ⅡA處理的同時皮下植入滲透泵連續泵入antagomirs。antagomirs是與膽固醇分子耦聯的寡聚核苷酸，可與細胞質內的成熟mircoRNA特異性結合，從而阻止mircoRNA與其特定mRNA結合[11]，而針對miR-133設計的antagomirs可有效的沉默miR-133。antagomirs在體內非常穩定，經靜脈注射后，沉默體內特異性miRNA的時間長達1周[12]。本研究結果顯示，經antagomirs處理后，心肌細胞肥大、膠原增生、心功能較丹參酮ⅡA組惡化，表明antagomirs可以下調miR-133的表達，從而部分消除丹參酮ⅡA抗心力衰竭大鼠左心室重構的作用。

綜上所述，miR-133在丹參酮ⅡA抗心力衰竭大鼠左心室重構中發揮著重要的作用，丹參酮ⅡA可能通過上調miR-133水平發揮抗心力衰竭心肌重構的作用。此研究為慢性心力衰竭的治療提供了臨床思路，即可基因水平治療心血管疾病，而且miR-133可能成為新的診斷工具，并可能成為藥物的治療靶點。

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Effect of Tanshinone ⅡA on myocardial remodeling in rats with heart failure by regulating the level of miR-133

FENG Jun，CHEN Huawen

(Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College,HuaZhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，Hubei, China)

Abstract:Objective It is to investigate the effect of miR-133 on myocardial remodeling in rats with chronic heart failure induced by Tanshinone ⅡA. Methods SD rats were randomly divided into sham operation group, operation group, Tanshinone ⅡA group, miR-133 inhibition group, each group had 10 rats. All the rats in every group except in sham operation group were given abdominal aortic constriction (AAC) to establish chronic heart failure. All the rats were normally fed for 4 weeks, then Tanshinone ⅡA group, miR-133 inhibition group were respectively treated with Tanshinone ⅡA by gavage and antagomirs by implantable “osmotic pumps”, sham operation group and operation group were given the same dose of normal saline by gavage. All the rats were treated for 12 weeks. Cardiac function, cardiac index, left ventricular mass index,morphology and pathological changes were analyzed in 24 h after the end gavage. Results Compared with sham group, cardiac function got worse, cardiac index,left ventricular mass index, cardiac muscle cell diameter and collagen content increased in operation group(P<0.05); the indexes above were obviously improved in Tanshinone ⅡA treatment group and miR-133 inhibition group(P<0.05), and the improvements in the former group were more significant. Conclusion miR-11 plays an important effect in anti-remodeling of left ventricular in the rats with heart failure, Tanshinone ⅡA maybe resist the cardiac remodeling of heart failure rats by up regulating miR-133 levels.

Key words:Tanshinone ⅡA; miR-133; heart failure; cardiac remodeling

[收稿日期]2015-11-02

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)08-0803-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.08.002

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(81202825)；湖北省自然科學基金資助項目(2012FFB02410)

[作者簡介]馮俊，男，博士，副主任醫師，研究方向為心血管疾病。[通信作者]陳華文， E-mail:andyterry555@163.com