脂多糖干預時間與小膠質細胞生成IL-1β和TNF-α時效關系的研究

白玉娟，李琦軍，周紅艷，李　炎，張國亮

(河北省石家莊市第三醫院，河北 石家莊 050011)

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脂多糖干預時間與小膠質細胞生成IL-1β和TNF-α時效關系的研究

白玉娟，李琦軍，周紅艷，李炎，張國亮

(河北省石家莊市第三醫院，河北 石家莊 050011)

[摘要]目的以原代培養的大鼠皮質小膠質細胞為研究對象，觀察脂多糖(LPS)處理小膠質細胞時間與小膠質細胞生成白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的時效關系，尋找能夠使小膠質細胞產生大量IL-1β、TNF-α的LPS最佳干預時間，為建立最佳小膠質細胞炎癥模型提供依據。方法培養原代大鼠皮質小膠質細胞，隨機分為10組，5組為LPS組，以含LPS(終濃度為100 ng/mL)的無血清膠質細胞培養液分別孵育1 h、3 h、6 h、12 h、24 h；每個LPS組均設平行對照，對照組用無血清膠質細胞培養液孵育，孵育時間同LPS組。孵育結束后，ELISA方法檢測各組培養液中IL-1β和TNF-α蛋白含量，RT-PCR方法檢測小膠質細胞中IL-1β mRNA和TNF-α mRNA表達水平。結果孵育原代小膠質細胞1 h、3 h、6 h、12 h、24 h后，LPS組培養液中IL-1β和TNF-α蛋白含量及小膠質細胞中IL-1β mRNA和TNF-α mRNA表達水平均明顯高于對照組(P均<0.05)；LPS組培養液中IL-1β和TNF-α蛋白含量及小膠質細胞中IL-1β mRNA和TNF-α mRNA表達水平隨著處理時間延長逐漸上升，IL-1β在3 h達到高峰，TNF-α在6h時達到高峰，二者在6 h均處于較高水平，以后隨時間延長逐漸下降，相鄰LPS處理組間比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。結論LPS能夠刺激小膠質細胞大量產生IL-1β和TNF-α，這種效應與LPS刺激時間相關，在刺激6 h時IL-1β和TNF-α均處于較高水平，LPS刺激6 h時是理想的小膠質細胞炎癥模型。

[關鍵詞]脂多糖；小神經膠質細胞；白細胞介素-1β；腫瘤壞死因子α

炎癥反應是機體組織對各種損傷產生的防御反應，過度和長期的炎癥反應可以引起組織損害，炎癥與中樞神經系統疾病有著密切關系。小膠質細胞是一種廣泛分布于中樞神經系統的巨噬細胞[1]，其在中樞神經系統內有免疫監視功能，當腦組織出現病理改變時，小膠質細胞受刺激迅速變為活化狀態，通過產生炎癥因子，抗原提呈、細胞毒性發揮天然免疫作用，是神經系統疾病與免疫反應相聯系的重要媒介[2]。小膠質細胞還是大腦中產生炎癥因子的主要細胞之一，參與介導神經系統炎癥反應[3-4]，其受到刺激后，可釋放白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等細胞因子以及其他一些生物活性物質[5]，而某些物質的過分釋放會導致神經元損傷[6-7]。IL-1β和TNF-α是最常見的細胞因子，在中樞神經系統多種生理和病理過程中發揮著重要作用[8-9]。隨著IL-1β和TNF-α在腦組織內濃度的增加，會對周圍的神經元產生毒性作用。脂多糖(LPS)是一種磷脂，能夠激活小膠質細胞，在小膠質細胞生物活性研究中常用LPS作為激活劑。LPS激活后的小膠質細胞會生成多種生物活性物質，這些物質在中樞神經系統炎癥反應及病理損傷過程中起著關鍵作用[10-11]，而被LPS激活的小膠質細胞產生的細胞因子與LPS干預時間的時效關系對于建立小膠質細胞炎癥模型有著重要意義。本研究用體外培養的原代大鼠皮質小膠質細胞來驗證LPS對小膠質細胞的激活作用以及小膠質細胞激活后產生IL-1β、TNF-α的量與LPS作用時間的關系，旨在尋找能夠使小膠質細胞產生大量IL-1β、TNF-α的LPS最佳干預時間，為建立最佳的小膠質細胞炎癥反應模型提供實驗依據，現報道如下。

1實驗資料

1.1動物24 h內新生SD大鼠30只，清潔級，河北醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號SCXK(冀)2013-1-03。

1.2主要試劑和儀器小鼠單克隆抗體IBA-1、LPS(美國Sigma公司)，FITC標記的山羊抗小鼠IgG(美國Proteintech公司)，胎牛血清、DMEM/F12培養液(美國Gibco公司)，ELISA試劑盒(中國Bio-Swamp公司)，GoldViewⅠ型核酸染料(美國Ameresco公司)，Trizol(美國Invitrogen公司)，RT-PCR逆轉錄試劑盒、RNA酶抑制劑(RNasin)、PCR擴增試劑盒、隨機引物 ( Random primers)(美國Promega公司)。酶標儀(芬蘭Theromo Labsystems公司)，超凈工作臺(日本Sanyo公司)， DMI3000B+DFC450C型熒光顯微鏡(德國Leica公司)，實時定量PCR擴增儀(美國ABI公司)，凝膠成像系統(GDS8000) (美國UVP公司)，Mastercycler gradient PCR儀(德國Eppendorf公司)

1.3小膠質細胞培養參照Nakajima等[12]所述方法。24 h內新生大鼠無菌環境下開顱取腦，剝除腦膜及血管，取部分大腦皮質，剪碎后用0.125%胰蛋白酶37 ℃消化15 min后，反復吹打成懸液，1 000 r/min離心5 min后過濾，棄上清，在沉淀物中加入膠質細胞培養液(為含10%胎牛血清、1 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養基制成細胞懸液)，接種于250 mL培養瓶中，37 ℃、5%CO2培養。第2天全量換液1次，以后每3 d更換1/2體積培養液。培養至第14天，細胞充分分層生長后，置于37 ℃恒溫搖床中180 r/min振搖2 h，收集細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，去上清，用DMEM/F12全培養基吹打成細胞懸液，將細胞調至約1×108L-1，種植到預先鋪好多聚賴氨酸的六孔板內，每孔3 mL。在恒溫培養箱內靜置30 min后完全換液1次，去除少突膠質細胞，加入 DMEM/F12完全培養基繼續培養3～5 d。

1.4小膠質細胞形態學觀察分離純化好的小膠質細胞分別以1×104個細胞/皿接種于預先放置經多聚賴氨酸處理過的蓋玻片的3.5 cm培養皿，24 h后取出蓋玻片，以IBA-1為一抗，行免疫細胞化學染色，熒光顯微鏡下觀察原代大鼠皮質小膠質細胞形態。

1.5小膠質細胞培養液中IL-1β、TNF-α蛋白的檢測分離純化好的小膠質細胞以5×105個細胞/孔接種于經多聚賴氨酸處理過的6孔培養板，培養2 d后，更換新鮮無血清膠質細胞培養液孵育細胞12 h,將6孔板各孔分為10組，每組3孔，5組作為LPS組，分別以含LPS(終濃度為100 ng/mL)的無血清膠質細胞培養液孵育1 h、3 h、6 h、12 h、24 h。各LPS處理組均設平行對照組，用無血清膠質細胞培養液孵育1 h、3 h、6 h、12 h、24 h。孵育結束后，取各組培養液，ELISA法檢測培養液中IL-1β、TNF-α蛋白含量。

1.6小膠質細胞中TNF-α mRNA、IL-1β mRNA表達水平的檢測將上述各組六孔板中的細胞培養液去除，向各孔加入Trizol(1 mL/孔)，吹打后移至去核酶的離心管中，靜置5 min。每管加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩15 s，使其盡量混勻，靜置5 min。12 000 r/min離心15 min，將上層無色液體移到新的離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻。4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，管底可見羽毛狀白色沉淀物，完全棄去上清。加入1 mL 75%乙醇(DEPC水配置)，洗滌沉淀。4 ℃ 7 500 r/min離心5 min，棄上清。靜置晾干3～5 min，加入20～30 μL DEPC水充分溶解RNA。放置于-70 ℃冰箱備用。取3 μL上樣緩沖液與上述DEPC水溶解好的RNA 5 μL充分混勻，加入含2%瓊脂糖凝膠(含0.01% GlodviewⅠ核酸染料)的加樣孔中進行電泳，電泳條件為：電壓120 V，時間5 min。在紫外線下觀察電泳條帶，可見5 s條帶不明顯，18 s、28 s條帶明亮清晰， 28 s條帶的亮度和寬度約為18 s條帶的2倍，未見大分子的DNA條帶，說明提取的RNA完整性好，無DNA污染。RNA純度測定采用紫外分光光度計檢測法。上述DEPC水溶解好的RNA 2 μL溶于1 mL三蒸水中，測定其在260 nm和280 nm的吸光度值(OD值)，計算OD260與OD280的比值；比值為1.81，說明提取的RNA有較高的純度，無污染，可用于下一步的反轉錄反應。RNA含量根據公式A260×稀釋倍數×40 μg計算，結果為1 540 g/mL。實時熒光定量PCR反應中反轉錄反應體系為：Total RNA 8 μL，Random Primer 1 μL，2×ES Reaction Mix 10 μL，RT/RI Enzyme Mix 1 μL。總體積20 μL。將反轉錄體系充分混勻，mini離心機瞬時離心。反應條件：25 ℃ 10 min，42 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min。生成的CDNA稀釋20倍，混勻后放入-20 ℃冰箱備用。大鼠IL-1β和TNF-α的引物序列(上海生工生物公司合成)：IL-1β上游引物序列為5’-CTCCATGAGCTTTGTACAAGG-3’，下游引物序列為5’-TGCTGATGTACCAGTTGGGG-3’， 產物長度245 bp；TNF-α上游引物序列為5’-TGCCTCAGCCTCTTCTCATT-3’， 下游引物序列為5’-GCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3’，產物長度208 bp；GAPDH上游引物序列為5’-TGAACGGGAAGCTCACTGG -3’，下游引物序列為5’-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC -3’，產物長度120 bp。擴增體系為：2×UltraSYBR Mixture(with ROX)10 μL，Forward Primer(10 μmol/L)1 μL，Reverse Primer(10 μmol/L)1 μL，cDNA 8 μL。總體積20 μL。RT-PCR反應程序參數：預變性95 ℃ 10 min ，變性95 ℃ 15 s，退火58 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 27 s，40個循環。擴增結束后，進入ABI 7300 Real-Time PCR System結果分析界面，檢測并計算目的基因表達量與內參GAPDH基因比較的相對值(RQ值)，用于統計分析。

2結果

2.1原代小膠質細胞形態學表現分離純化后的小膠質細胞，胞體較小，細胞上有細長突起(箭頭)，星形膠質細胞和神經元細胞已經很難看到，見圖1。經IBA-1免疫細胞化學熒光染色后，可見IBA-1將胞體和突起染成紅色，Hoechst 33258復染后將胞核染成藍色，胞體可見呈分支狀或者梭形，伴有細長的突起(箭頭)，經鑒定，小膠質細胞純度大于95%，滿足實驗需要，見圖2。

2.2不同孵育時間原代小膠質細胞培養液中IL-1β和TNF-α含量變化孵育原代小膠質細胞1 h、3 h、6 h、12 h、24 h后，LPS組培養液中IL-1β和TNF-α含量與相應對照組相比均顯著增高(P均<0.05)；且原代小膠質細胞生成IL-1β和TNF-α的量隨LPS干預時間延長逐漸增加，分別在3 h和6 h達到高峰，隨后隨時間延長逐漸下降，各相鄰LPS處理組間膠質細胞培養液中IL-1β和TNF-α含量比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。對照組無此相應變化。見表1。

圖1　原代培養的小膠質細胞形態表現 (×400)

圖2　IBA-1免疫熒光染色后小膠質細胞形態表現(×600)

表1　不同孵育時間原代小膠質細胞培養液中IL-1β和TNF-α含量變化

注：①與對照組比較，P<0.05。

2.3不同孵育時間原代小膠質細胞中IL-1β mRNA和TNF-α mRNA表達量變化孵育原代小膠質細胞1 h、3 h、6 h、12 h、24 h后，LPS組小膠質細胞中IL-1β和TNF-α mRNA表達量與相應對照組相比均顯著增高(P均<0.05)；且LPS組小膠質細胞中IL-1β mRNA表達量在3 h、TNF-α mRNA表達量在6 h達到高峰，隨后隨時間延長逐漸下降。各相鄰LPS處理組間小膠質細胞中IL-1β mRNA和TNF-α mRNA表達量比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。對照組無此相應變化。見表2。

3討論

表2　不同孵育時間原代小膠質細胞中IL-1β mRNA和TNF-α mRNA表達量變化

注：①與對照組比較，P<0.05。

小膠質細胞廣泛分布于中樞神經系統內，在成人中樞神經系統中，小膠質細胞約占膠質細胞總數的15%。小膠質細胞是腦內重要的免疫細胞，在介導免疫反應時起著主要作用。未被激活的小膠質細胞有細長的突起，成分支狀，能夠分泌少量生長因子，起到維持神經元存活的作用。當腦內內環境發生變化時，小膠質細胞迅速被激活，激活的小膠質細胞形態可從分支狀變成圓形或阿米巴狀，細胞內多種細胞因子的轉錄和表達也隨之增高，釋放各種生物活性物質，如細胞因子、趨化因子、活性氧、活性氮和前列腺素等。其中小膠質細胞產生的IL、TNF是現在研究比較多的與中樞神經系統功能關系密切的細胞因子。IL是一種重要的前炎癥因子，能夠參與中樞神經系統內的神經-免疫-內分泌系統之間的調控，起到調節神經系統功能的作用。研究表明，發生中樞神經系統損傷后，腦內IL-1β水平會明顯升高，說明其與腦功能損傷有著密切聯系[13-14]。Fukuda等[15]研究IL-1β在癲癇中的作用時，采用高溫誘導大鼠驚厥的方法，觀察到IL-1β能夠促進高溫誘導的大鼠驚厥的發生。IL-1Ra 是IL-1受體拮抗劑，當IL-1Ra基因缺失時，IL-1Ra生成受阻，對IL-1β抑制作用減弱，也易發生熱性驚厥；腦內注射IL-1Ra后可以觀察到明顯的抗驚厥和保護神經元的作用[16]。但也有觀點認為IL-1β有抗癲癇的作用，Oprica 等[17]認為IL-1β對神經元有保護作用，能夠減弱海人藻酸(KA)所致的神經元損傷。由此可見，IL-1β對中樞神經系統的影響具有兩面性，一方面加重中樞神經的損傷，另一方面能夠通過促進神經營養因子產生起到保護神經元的作用，二者作用機制可能不同，可能在炎癥反應發生的不同階段通過不同途徑發揮著不同的作用。有必要對炎癥發生后不同時段IL-1β及其他炎癥因子的產生規律進行研究，以明確其對神經元的作用機制。TNF-α是由小膠質細胞、星形膠質細胞分泌的一種重要的前炎癥因子，其和IL-1β一樣，也與中樞神經系統損傷有著密切關系[18]。

LPS是革蘭陰性桿菌細胞壁的組成成分，其對神經元影響不大，很適合做小膠質細胞活性的研究。LPS產生的炎癥反應是由Toll樣受體4(TLR4)介導的，它可以促使小膠質細胞分泌多種炎癥遞質[19-20]。TLR4通過MyD88依賴和非依賴兩條通路激活核轉錄因子，而激活后的核轉錄因子能夠進入胞核，啟動IL-1、IL-6、TNF-α等相關基因的表達和蛋白的合成，促進炎癥因子的生成和釋放，釋放到體液中的炎癥因子參與炎癥反應[21-23]。當損傷因素出現時，TLR4信號通路被激活并產生各種炎性因子，這些炎癥因子在中樞神經系統損傷過程中起著重要作用。用LPS誘導小膠質細胞炎癥反應時，LPS的作用時間與炎癥因子的產生密切相關，只有合理的LPS作用時間才能夠建立最佳的炎癥反應模型。

本實驗結果表明，以LPS(100 ng/mL)處理小膠質細胞后，培養液中IL-1β、TNF-α蛋白含量及小膠質細胞中IL-1β mRNA和TNF-α mRNA表達量明顯增高，增高程度與LPS干預時間有關，小膠質細胞被LPS激活1 h后，IL-1β、TNF-α蛋白含量和mRNA表達量便明顯上升，在LPS處理3 h，IL-1β達到高峰，以后隨時間增加逐漸降低。而TNF-α則是在LPS處理6 h達到峰值，以后隨時間增加而降低，到24 h時培養液中的IL-1β、TNF-α的含量和小膠質細胞中IL-1β mRNA和TNF-α mRNA表達量仍明顯高于對照組。在LPS處理6 h時，培養液中IL-1β、TNF-α蛋白含量及小膠質細胞中IL-1β mRNA和TNF-α mRNA表達量均處于較高水平。提示LPS能夠促進小膠質細胞產生IL-1β、TNF-α，這種效應與LPS的作用時間相關。在LPS作用6 h時二者均處于較高水平，故認為LPS刺激6 h時是理想的小膠質細胞炎癥模型。

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Study on time-effect relationship of IL-1β and TNF-α coming from microglia treated with LPS

BAI Yujuan, LI Qijun, ZHOU Hongyan, LI Yan, ZHANG Guoliang

(The Third Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050011, Hebei, China)

Abstract:Objective Primary cerebral cortical microglia of rat was cultured and treated with LPS to observe the time-effect relationship of IL-1β and TNF-α with treatment time of LPS, in order to find when microglia generate a large amount of IL-1β and TNF-α with the treatment to provide evidences for the establish of best microglia inflammatory models. Methods Primary cerebral cortical microglia of SD rat was cultured and divided into 10 groups randomly ,five groups were treated with serum-free medium included LPS(final concentration 100 ng/mL) for different time (1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h). Parallel control groups were arranged to each above groups and treated with serum-free medium for the same time. And then,the protein levels of IL-1β and TNF-α in the culture media were detected through ELISA and the expressions of IL-1β mRNA and TNF-α mRNA in the microglia cells were detected through RT-PCR. Results After 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h of treatment by LPS, the protein levels of IL-1β and TNF-α in the culture media and mRNA expression levels of IL-1β and TNF-α in the microglia cells of LPS groups increased remarkably compared with the control groups (P<0.05); the time point of the highest expression of IL-1β was 3 h, the time point of the highest expression of TNF-α was 6 h, both of their amount stayed at higher status at 6 h, and then declined little by little with the extension of the time,and the differences were significant between every groups(P>0.05). Conclusion LPS can stimulate microglia cells to generate a large amount of IL-1β and TNF-α and this is time-depended , both of their amount stay at higher status at 6 h. It is better model of inflamation when microglia was treated with LPS for 6 h.

Key words:LPS; microglia; interleukin-1β; Tumor necrosis factor-α

[收稿日期]2015-10-30

[中圖分類號]R-33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)08-0828-05

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.08.009

[作者簡介]白玉娟，女，主管護師，從事神經電測聽工作。[通信作者]李琦軍，E-mail：13832121438@163.com