全二維液相色譜的構(gòu)建及其在鹿茸蛋白分離中的應(yīng)用

周　杰

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000 )

?

全二維液相色譜的構(gòu)建及其在鹿茸蛋白分離中的應(yīng)用

周杰

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000 )

[摘要]目的建立SAX-RP模式的在線二維液相色譜系統(tǒng)，并將其應(yīng)用于鹿茸蛋白的分離、分析中。方法樣品首先由第一維強陰離子交換色譜(COSMOGEL QA Glass Packed Column,75 mm×8.0 mm I.D)在pH 9.16的Tris-HCl緩沖體系中以0.8 mL/min的流速洗脫分離，采用不連續(xù)的逐步增加鹽濃度的8步臺階梯度方式洗脫，洗脫產(chǎn)物富集在與反相柱相同填料的捕集柱頂端，通過閥切換將富集在捕集柱上的組分反向沖入第二維反相分析柱(Shodex Rspak RP18～415,150 mm×4.6 mm I.D)繼續(xù)分析。結(jié)果鹿茸蛋白在所構(gòu)建的二維系統(tǒng)上得到了較好的分離，與一維色譜相比，系統(tǒng)的總峰容量、分辨率在一定程度上得到了提高，系統(tǒng)總出峰數(shù)為30，總峰容量為240。結(jié)論使用常規(guī)尺寸的色譜柱構(gòu)成的二維液相色譜系統(tǒng)儀器要求簡單，對鹿茸為代表的動物類中藥的分離、分析有一定指導(dǎo)意義。

[關(guān)鍵詞]全二維液相色譜；鹿茸蛋白；SAX/RP

中藥組成成分極其復(fù)雜，特別是中藥中的動物藥，常常含有幾百甚至上千種組分。對復(fù)雜組份的分離，傳統(tǒng)的色譜方法受到峰容量和分辨率的限制，遠不能滿足分離的要求，而組合不同模式構(gòu)建多維系統(tǒng)是解決這一問題的有效途徑。二維液相色譜由2種不同分離機理的液相色譜模式通過一定的切換接口構(gòu)成，樣品經(jīng)第一維色譜分離后，由切換接口導(dǎo)入第二維色譜繼續(xù)分離。二維液相色譜大大提高了整個系統(tǒng)的分辨率和峰容量，在蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物分析中得到了廣泛的應(yīng)用[1-3]。根據(jù)不同分離目的，尺寸排阻色譜(SEC)、離子交換色譜(IEC)、反相色譜(RP)、疏水作用色譜(HIC)、親和色譜(AC)等都可以用于構(gòu)建二維液相色譜系統(tǒng)。IEC/RP模式因其具有溶劑匹配，易與質(zhì)譜連接，可以提高進樣量及方便實現(xiàn)快速分析等特點，在生物樣品的分離分析中有廣泛的應(yīng)用[4-8]。本研究以常規(guī)尺寸的色譜柱構(gòu)建全二維液相色譜，第一維根據(jù)樣品所帶電荷采用強陰離子交換色譜(SAX)進行分離，第二維根據(jù)樣品極性差異采用反相液相色譜(RP)進一步分離，采用捕集柱富集接口，構(gòu)建正交的SAX/RP 在線二維液相色譜分離系統(tǒng)，并將此二維系統(tǒng)用于鹿茸蛋白的分離分析中，取得了較好的結(jié)果?，F(xiàn)報道如下。

1實驗資料

1.1儀器與試劑色譜系統(tǒng)為Agilent 1100系列(美國安捷倫公司)、島津10A系列(日本島津公司)，7725i六通閥(美國RHEODYNE公司)。第一維SAX柱為CO-SMOGEL QA Glass Packed Column(8.0 mm×75 mm，10 μm，1 000 ?)，日本Nacalai tesque公司；第二維RP柱為Shodex RSpak RP18-415(4.6 mm×150 mm，6 μm，450 ?)，捕集柱為RSpak RP18-G(4.6 mm×10 mm，6 μm，450 ?)，均購于日本Shodex公司。乙腈(ACN，色譜純，美國Fisher公司)、三氟乙酸(TFA，色譜純，美國Fisher公司)、三羥甲基氨基甲烷(Tris，北京拜耳迪公司)；實驗用水為優(yōu)普超純水器(成都超純科技有限公司)制備；其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2樣品與處理鹿茸來源于內(nèi)蒙古赤峰雄性馬鹿茸，采茸方式為全身麻醉消毒鋸茸留血密封后冷藏運輸，2h內(nèi)放置-80 ℃冷凍保存。取凍鮮馬鹿茸10 g，解凍至冰血融化，切薄片，用預(yù)冷的蒸餾水(4 ℃)沖洗至無血色；4 ℃下，用50 mL的Tris-HCl緩沖液(50mmol/L，pH=7)浸提24h；在圓桶里裝滿冰袋，將電動勻漿機放入其中，制備一個小型的密閉冰柜；將浸提液加鹿茸組織放入勻漿機中勻漿3次，每次10 s，其間暫停3 s，使其充分散熱，收集滲出液；將滲出液與殘渣合并，4 ℃下浸提24 h；用冷凍高速離心機(10 000 r/min，4 ℃)離心20 min，取上清，得到待測樣品。

1.3系統(tǒng)組成本文采用SAX/RP模式構(gòu)建正交的在線二維液相色譜分離系統(tǒng)，第一維SAX根據(jù)樣品所帶電荷不同進行分離，第二維RP根據(jù)樣品極性的差異進一步分離，中間接口以捕集柱為橋梁，由閥接口進行切割轉(zhuǎn)移，其流程如圖1所示。該系統(tǒng)由2臺色譜泵、3個六通進樣閥、1根強陰離子交換色譜柱、1根反相色譜柱、1根捕集柱、2臺紫外檢測器組成。其中，切換閥1的1，2，3，4，5號孔分別與廢液瓶、檢測器1、捕集柱進口端、分析柱2、切換閥2的3號孔相連；切換閥2的1，2，6號孔分別與捕集柱出口端、泵2、廢液瓶相連。如圖1所示A狀態(tài)，泵1、泵2同時運行，實現(xiàn)進樣、樣品第一維SAX分離，分析柱2進行流動相的平衡；B狀態(tài)，泵1、泵2同時運行，第一維洗脫的樣品組分在捕集柱柱頂富集，而不保留的鹽分和多余的第一維流動相流入廢液裝置，分析柱2繼續(xù)流動相的平衡；C狀態(tài)，泵1停止，泵2運行，將通過第一維離子交換分析后富集在捕集柱上的組分反向沖入第二維的反相分析柱繼續(xù)分析。重復(fù)以上過程，直到樣品分析完。

2結(jié)果

2.1樣品提取條件的選擇本文考察提取溶劑Tris-HCl濃度10,20,30,50 mmol/L，pH 7.00,8.00,9.00，提取次數(shù)1,2,3,4,5次。最終確定Tris-HCl濃度為50 mmol/L，pH值為7，提取次數(shù)為3效果最好，故本實驗采用此方法。

2.2一維SAX條件的選擇由于大多數(shù)蛋白質(zhì)含酸性基團多于堿性基團，其pH<7，一般情況下帶負電荷，陰離子交換柱的固定相基團帶正電荷，其可交換離子為陰離子，其pH適應(yīng)范圍廣，離子化程度高，重現(xiàn)性好，且強陰離子交換柱(SAX)相比弱陰離子交換柱(WAX)具有更大的蛋白質(zhì)負載量，所用流動相的pH條件更接近于生理pH，能減少部分蛋白質(zhì)在酸性條件下的損失[9]，因此本研究采用SAX作為第一維分離柱。本文考察流動相Tris-HCl緩沖液濃度10，30，50 mmol/L，pH 7.00，8.00，9.00，9.06，9.16，最終確定Tris-HCl緩沖液的濃度為30 mmol/L，pH為9.16分離效果最好。本研究還不斷優(yōu)化了臺階梯度洗脫條件，可見鹿茸蛋白在第一維SAX上得到較好的分離，見圖2。

色譜柱：COSMOGEL QA Glass Packed Column,10 μm,75 mm×8.0 mm I.D；流動相為A:30 mmol/L Tris-HCl(pH 9.16)，B:30 mmol/L Tris-HCl+1 mmol/L NaCl(pH 9.16)；8個臺階梯度依次為0% B，12% B，15% B，20% B，30% B，50% B，60%B，100% B；流速0.8 mL/min；檢測波長280 nm。

2.3一維RP條件的選擇第二維反相色譜比較了Shodex RSpak RP18-415(4.6 mm×150 mm，6 μm，450 ?)和ShodexAsahipak ODP-50 4D(4.6 mm×150 mm，5 μm，250 ?)兩種規(guī)格的色譜柱，在相同色譜條件下，Shodex RSpak RP18-415較Shodex Asahipak ODP-50 4D保留時間小，分辨率更高，因此選用Shodex RSpak RP18-415作為第二維反相色譜分析柱。實驗中還考察了流動相酸種類三氟乙酸、甲酸，酸濃度0.03%，0.05%，0.10%，柱溫20 ℃，30 ℃，40 ℃，流速0.6，0.8，1 mL/min。最終確定流動相中含0.10%三氟乙酸，柱溫為30 ℃，流速為1 mL/min，不斷優(yōu)化了梯度洗脫條件，確定了45min的洗脫條件，得到鹿茸蛋白一維反相色譜分析圖，見圖3。

A為第一維SAX分離；B為樣品捕集；C為第二維RP分離。

圖2　鹿茸蛋白一維SAX分離色譜圖

色譜柱：Shodex RSpak RP18-415,6 μm,150 mm×4.6 mm，I.D；流動相為：A:H2O+ 0.1% trifluo-?roacetic acid(TFA)，B:乙腈(acetonitrile)+0.085% TFA；梯度條件：0-0-45-65-100-100B% (0-5-15-35-37 min)；流速1 mL/min；檢測波長280 nm。

2.4在線二維SAX-RP切換分析鹿茸蛋白經(jīng)第一維SAX分離的組分在捕集柱上得以富集、脫鹽，通過六通閥的切換，第二維的流動相將捕集柱上的蛋白質(zhì)反沖至反相分析柱上進行分離。在實驗條件下二維分析結(jié)果見圖4。

圖3　鹿茸蛋白一維反相色譜分析圖

圖4　鹿茸蛋白分析的三維圖譜

3討論

多維色譜的切換方式有部分切換和整體切換，整體切換又分按時間切換和按峰切換，按時間切換模式即每隔一定時間切換一次，按峰切換模式即在色譜峰出現(xiàn)后的某個時間點進行切換。由前面的實驗知鹿茸的總蛋白成分并不是很復(fù)雜，在離子交換色譜中，各個峰又相差較遠，采用按時間切換會浪費時間，因此本研究采用按色譜峰切換方式，這樣目的性更強，更節(jié)約時間。如上所述，系統(tǒng)的總出峰數(shù)相比一維的RP系統(tǒng)增加不到3倍，是鹿茸總蛋白成分本身不復(fù)雜，還是采取按色譜峰切換方式切割次數(shù)相對較少等原因，本課題將繼續(xù)進行下一步實驗研究。

本文建立了以捕集柱為切換接口的SAX-RP在線二維液相色譜系統(tǒng)，并將其用于鹿茸蛋白的分離分析中，二維系統(tǒng)的總出峰數(shù)為30，總峰容量為240。與一維色譜相比，系統(tǒng)的總峰容量、分辨率在一定程度上得到了提高。本文使用常規(guī)尺寸的色譜柱構(gòu)成的二維液相色譜系統(tǒng)儀器要求簡單，對鹿茸為代表的動物類中藥的分離、分析有一定指導(dǎo)意義。

[參考文獻]

[1]Dvais MT,Beierle J,Bures ED,et al. Automated LC-LC-MS-MS platform using binary ion-exchange and gradient reversed-phase chromatography for improved proteomic analyses[J]. Chromatogr B,2001,752(2):281-291

[2]黃志，洪廣峰，高明霞，等. 用于人血漿中蛋白質(zhì)分離的在線陣列式二維常規(guī)柱液相色譜系統(tǒng)的建立[J]. 色譜，2014,32(4):343-348

[3]李威，肖軼雯，邱細敏，等. 2D-HPLC結(jié)合捕集柱同時測定黃連藥材中6個生物堿[J]. 藥物分析雜志，2014,32(4):654-658

[4]王智聰，張慶合，張維冰，等. 全二維液相色譜(IEC/RP)的構(gòu)建與評價[J]. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報，2005,26(3):426-429

[5]宋倫，李篤信，張凌怡，等. IEX/RP二維液相色譜中弱保留組分收集模式的構(gòu)建及系統(tǒng)評價[J]. 分析測試學(xué)報，2009,28(11):1266-1269；1274

[6]李篤信，張凌怡，李彤，等. 二維液相色譜接口的改進及其在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用(英文)[J]. 色譜，2010,28(2):163-167

[7]Mitulovic G,Stingl C,Smoluch M,et al. Automated,on-line two-dimensional nano liquid chromatography tandem mass spectrometry for rapid analysis of complex protein digests[J]. Proteomics,2004,4(9):2545-2557

[8]Mawuenyega KG,Kaji H,Yamauchi Y,et al. Large-scale identification of Caenorhabditis elegans proteins by multi-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Proteome Research,2003,2(1):23-35

[9]朱紹春，張學(xué)洋，高明霞，等. 去除血漿中高豐度蛋白質(zhì)的二維液相色譜體系的建立[J]. 色譜，2011,29(9):837-842

[10] Jinzhi C,Balgley BM,DeVoe DL,et al. Capillary isoelectric focusing-based multidimensional concentration/ separation platform for proteome analysis[J]. Anal Chem，2003,75(13):3145-3152

[11] Moore AW,Jorgenson JW. Comprehensive three-dimensional separation of peptides using size exclusion chromatography/reversed phase liquid Chromatography/ optically gated capillary zone electrophoresis[J]. Anal Chem,1995,67(19):3456-3463

[12] Giddings JC. Two-dimensional separations: concept and promise[J]. Anal Chem,1984,56(12):1258A-1270A

[收稿日期]2015-08-31

[中圖分類號]R284.2

[文獻標(biāo)識碼]B

[文章編號]1008-8849(2016)04-0437-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.04.035