NQO1過表達在卵巢黏液性囊腺癌預后評估中的意義*

徐 明， 楊 洋， 車拴龍， 樸英實， 林貞花, ， 陳麗艷△

(延邊大學 1醫學院病理學教研室， 2腫瘤研究中心，吉林 延吉 133002)

NQO1過表達在卵巢黏液性囊腺癌預后評估中的意義*

徐 明1， 楊 洋1， 車拴龍1， 樸英實2， 林貞花1, 2， 陳麗艷2△

(延邊大學1醫學院病理學教研室，2腫瘤研究中心，吉林 延吉 133002)

目的： 探討NAD(P)H醌氧化還原酶1[NAD(P)H-quinone oxidoreductase 1，NQO1]過表達在卵巢黏液性囊腺癌臨床預后評估中的意義。方法: 應用免疫組化EnVision法檢測NQO1蛋白在162例卵巢黏液性囊腺癌組織、35例卵巢黏液性囊腺瘤組織和29例正常卵巢上皮組織中的表達，并分析其過表達與卵巢黏液性囊腺癌臨床病理學特點之間的關系，通過Kaplan-Meier方法進行生存分析。結果: NQO1蛋白在卵巢黏液性囊腺癌組織中的陽性率及強陽性率分別為85.8%和64.2%，顯著高于卵巢黏液性囊腺瘤和正常卵巢上皮組織(P<0.01)。卡方檢驗結果顯示，NQO1蛋白高表達與卵巢黏液性囊腺癌組織學分級和FIGO分期密切相關(P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析顯示，NQO1蛋白高表達的卵巢黏液性囊腺癌患者總生存期和無病生存期均明顯低于NQO1蛋白低表達患者。結論: NQO1蛋白在卵巢黏液性囊腺癌組織中呈高表達，可能成為卵巢黏液性囊腺癌預后評估的有效生物學指標。

卵巢黏液性囊腺癌； NAD(P)H醌氧化還原酶1； 免疫組化； 無病生存期； 預后

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，種類較多。其中，卵巢黏液性囊腺癌是常見類型，發病率僅次于卵巢漿液性囊腺癌，但其5年生存期僅為30%左右[1]，嚴重威脅婦女的生命健康[2]。由于卵巢黏液性囊腺癌生長部位隱蔽，肉眼觀察不到，早期臨床癥狀與炎癥相似，體征不明顯，確診時多已發展為晚期，故其生存期短且預后差。因此，探討卵巢黏液性囊腺癌的發病機制，尋找其早期診斷和預后評估的有效指標極為重要。

NAD(P)H醌氧化還原酶1[NAD(P)H-quinone oxidoreductase 1，NQO1]以NAD(P)H為受體，催化醌類及其衍生物，避免其損傷細胞并保護機體免受致癌物影響[3]。有研究表明，NQO1蛋白在結直腸癌[3]、腎透明細胞癌[4]、肺癌組織[5]、子宮頸癌[6]、浸潤性卵巢癌[7]、胰腺癌[8]等多種惡性腫瘤異常表達，且其高表達與腫瘤發生發展密切相關。但目前尚未見NQO1蛋白與卵巢黏液性囊腺癌的相關報道。因此，本研究旨在應用免疫組化EnVision法檢測NQO1蛋白在卵巢黏液性囊腺癌組織中的表達情況，探討NQO1蛋白表達檢測在卵巢黏液性囊腺癌中的臨床病理學意義及其與患者生存期的關系，為卵巢黏液性囊腺癌預后評估提供新的分子指標。

材 料 和 方 法

1 臨床資料

臨床資料齊全的卵巢組織標本選自2000年1月～2010年12月延邊大學醫學院腫瘤組織庫和延邊婦幼保健院病理科。其中包括162例卵巢黏液性囊腺癌、35例卵巢黏液性囊腺瘤組織和29例正常卵巢上皮組織。162例卵巢黏液性囊腺癌患者中，年齡≥48歲的有98例，<48歲的有64例。根據國際婦科學會(FIGO)2014年修訂的卵巢癌分期標準對卵巢癌進行臨床分期，其中FIGO I-II期(早期)有93例，FIGO III-IV期(晚期)有69例。所有患者在術前均未接受放療或化療，患者隨訪均超過5年，平均生存時間為48.4個月，五年生存率為32.7%。

2 方法

免疫組化EnVision法檢測試劑盒為Dako產品；NQO1鼠抗人單克隆抗體購自Santa Cruz。染色步驟為常規脫蠟、抗原修復，加入 I 抗(1∶200稀釋)4 ℃孵育過夜；次日滴加 II 抗，DAB顯色，Mayer蘇木素復染，中性樹膠封片。為了證明NQO1蛋白抗體免疫組化檢測的特異性，實驗中應用了鼠IgG代替 I 抗作為對照，結果為陰性。同時，選擇NQO1蛋白陽性染色的切片，以PBS代替 I 抗染色的結果為陰性，以此作為結果可信的實驗依據。

3 結果判斷標準

免疫組化染色結果以雙評分半定量法進行判定。將有棕黃色顆粒在細胞漿內出現視為陽性。按染色強度，無著色記為0分，淡黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分；每張切片在高倍鏡(×400)下隨機選取10個視野，每個視野計數100個細胞進行分級，陽性細胞數占0%～5%的記為0分，陽性細胞數占5%～25%的記為1分，陽性細胞數占26%～50%的記為2分，陽性細胞數占50%～75%的記為3分，陽性細胞數>75%的記為4分。最后將兩項計分結果相乘，0分記為“-”，1～4分記為“+”，5～8分記為“++”，9～12分記為“+++”。陽性率是“+”、“++”和“+++”的病例數占總病例數的百分比；強陽性率是“++”和“+++”的病例數占總病例數的百分比。

4 統計學處理

應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，各組間NQO1蛋白表達的統計差異分析采用2檢驗，應用Kaplan-Meier進行生存分析，以P<0.05為差異有統計學顯著性。

結 果

1 NQO1蛋白在卵巢黏液性囊腺癌組織中過表達

NQO1蛋白在卵巢黏液性囊腺癌組織中主要呈現細胞漿表達，少量細胞核表達。NQO1蛋白在29例正常卵巢上皮組織中僅有3例呈現強陽性，陽性率是37.9%，強陽性率是10.3%；在162例卵巢黏液性囊腺癌組織中的陽性率和強陽性率分別是85.8%和64.2%；在卵巢黏液性囊腺瘤組織中的陽性率和強陽性率分別為60.0%和42.9%，差異有統計學顯著性(P<0.01)，見圖1、表1。

2 NQO1蛋白過表達與卵巢黏液性囊腺癌臨床病理參數的關系

NQO1蛋白高表達與卵巢黏液性囊腺癌的組織學分級和FIGO分級密切相關(P<0.05)，但是與患者的年齡和絕經狀態不相關。NQO1蛋白在組織學分級2級和3級中的表達明顯高于1級；而且在FIGO分級III～IV期(晚期)中NQO1蛋白高表達占95.7%，明顯高于I～II期(早期)，見表2。

Figure 1.IHC staining of NQO1 protein in ovarian samples (×400). A: weakly positive expression of NQO1 protein in ovarian mucinous cystadenoma; B: positive expression of NQO1 protein in ovarian mucinous cystadenocarcinoma; C: strongly positive expression of NQO1 protein in ovarian mucinous cystadenocarcinoma, which was mainly located in cytoplasm and gathered around the nucleus.

圖1 NQO1蛋白在卵巢組織中的表達

表1 NQO1蛋白在各組卵巢病變組織中的表達

*P<0.05,**P<0.01vsnormal ovarian epithelium;#P<0.01vsovarian mucinous cystadenoma.

表2 NQO1蛋白過表達與卵巢黏液性囊腺癌臨床病理參數的關系

3 NQO1蛋白過表達與卵巢黏液性囊腺癌患者生存期之間的關系

應用Kaplan-Meier方法分析162例卵巢黏液性囊腺癌的生存期與NQO1蛋白的關系，繪制生存曲線顯示，NQO1蛋白高表達的卵巢黏液性囊腺癌患者的總生存期和無瘤生存期均明顯低于NQO1蛋白低表達者(P<0.01)，見圖2，提示NQO1蛋白對卵巢黏液性囊腺癌患者生存期有顯著影響。

討 論

卵巢黏液性囊腺癌嚴重影響女性患者的生活質量，由于缺乏對卵巢黏液性囊腺癌的有效早期診斷以及分子治療靶點的識別，晚期卵巢黏液性囊腺癌患者的5年死亡率一直居高不下。因此，發現有效的卵巢黏液性囊腺癌早期診斷以及預后評估分子標志物，對提高患者生存率具有重要意義。

Figure 2. Kaplan-Meier survival curves illustrated the significance of NQO1 expression in ovarian mucinous cystadenocarcinoma. A: the correlation between NQO1 expression and overall survival rate; B: the correlation between NQO1 expression and disease-free survival rate.

圖2 NQO1表達與卵巢黏液性囊腺癌患者預后的Kaplan-Meier生存曲線

NQO1蛋白是一類普遍存在于真核細胞內的黃素蛋白酶，可為細胞提供多層次的氧化應激保護，包括高活性的醌類解毒、維護脂溶性抗氧化劑減少、穩定抑癌基因p53等[9-10]。NQO1基因位于人染色體16 q21～22區段，研究發現，其C609T位點易發生基因突變，可使機體重要的細胞防御機制無法抵抗光譜毒性物質及醌類衍生物對機體的致癌作用和其它毒性作用[11]。代恩勇等[12]應用聚合酶鏈反應-限制性片段多態性(PCR-RFLP)基因型分析技術對NQO1 cDNA 609位點多態性進行測定，結果證實NQO1基因多態性與大腸癌的發生有一定相關性。Fagerholm等[13]研究也提示NQO1基因表型可視為乳腺癌預后評估的標志。這可能是由于NQO1多態性導致黃素蛋白酶活性降低甚至失活，從而減弱或者喪失NQO1對細胞的保護作用，增加了個體患腫瘤的可能性。

近年來的研究發現，NQO1蛋白在多種腫瘤組織中呈現高表達。有文獻報道，通過免疫組化的方法和逆轉錄聚合酶鏈反應檢測出NQO1在腎透明細胞癌中呈高表達，且其高表達與腎透明細胞癌發生發展及預后密切相關[4]。本組實驗結果發現：與正常癌旁組織和卵巢黏液性囊腺瘤相比，卵巢黏液性囊腺癌中NQO1蛋白的陽性及強陽性表達明顯升高，且NQO1蛋白的表達與卵巢黏液性囊腺癌的組織學分級和FIGO分級顯著相關；結果還顯示隨著卵巢黏液性囊腺瘤惡性程度的增高，NQO1蛋白的表達也異常增高，以上均提示NQO1蛋白的表達可能在卵巢黏液性囊腺癌的發生、發展中發揮重要的作用。作為氧化應激反應的關鍵調節因子，NQO1蛋白在惡性腫瘤中高表達的分子機制有待于進一步研究。

本課題組的前期研究表明，NQO1蛋白在結直腸癌中呈高表達，是結直腸癌的獨立風險因子[3]；此外，通過Kaplan-Meier生存分析的結果表明，NQO1對頭頸部鱗狀細胞癌患者生存期有顯著影響[14]。Awadallah等[15]在胰腺導管腺癌中發現標記NQO1蛋白可以成為有用的臨床治療預后評估的輔助指標。在本研究中，通過生存分析發現，卵巢黏液性囊腺癌患者NQO1蛋白高表達組的總生存期和無病生存期與低表達組相比顯著降低，提示NQO1參與卵巢黏液性囊腺癌的進展，并可作為有效的預后評定指標之一。

綜上所述，NQO1蛋白在卵巢黏液性囊腺癌中表達明顯上調，為臨床上卵巢黏液性囊腺癌的預后判定提供了可能的理論依據。NQO1蛋白有期望成為臨床上卵巢黏液性囊腺癌的預后指標和潛在的分子靶向治療目標。

[1] Sant M, Aareleid T, Berfino F, et al. EUROCARE-3: survival of cancer patients diagnosed 1990-94: results and commentary[J]. Ann Oncol, 2003, 14(Suppl 5):v61-v118.

[2] 賀立彩，陳 尚，朱真鋒，等. Ikaros的3種亞型對人卵巢癌SKOV3細胞增殖的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(8):1407-1411.

[3] 馬 躍，林黎娟，樸俊杰，等. 結直腸癌中NQO1蛋白表達的臨床病理及預后意義[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2008, 30(4):366-370.

[4] 高 強，許 鵬，郭巖松，等. Nrf2、NQO1在腎透明細胞癌中的表達及意義[J]. 河北醫科大學學報, 2014, 35(4):421-423.

[5] 倪 靜，秦麗娟，吳擁軍，等. 肺癌組織中Nrf2、Keap1和NQO1蛋白的表達[J]. 鄭州大學學報：醫學版, 2012, 47(4):456-459.

[6] Ma Y, Kong JN, Yan GH, et al. NQO1 overexpression is associated with poor prognosis in squamous cell carcinoma of the uterine cervix[J]. BMC Cancer, 2014, 14:414.

[7] Cui XL, Li LH, Yan GH, et al. High expression of NQO1 is associated with poor prognosis in serous ovarian carcinoma[J]. BMC Cancer, 2015, 15:244.

[8] Awadallah NS, Dehn D, Shah RJ, et al. NQO1 expression in pancreatic cancer and its protential use as a biomarker[J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2008, 16(1):24-31.

[9] Nioi P, Hayes JD. Contribution of NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 to protection against carcinogenesis, and regulation of its gene by the Nrf2 basic-region leucine zipper and the arylhydrocarbon receptor basic helix-loophelix transcription factors[J]. Mutat Res, 2004, 555(1-2):149-171.

[10]Girolami F, Abbadessa G, Racca S, et al. Time-depen-dent acetylsalicylic acid effects on liver CYP1A and antioxidant enzymes in a rat model of 7,12-dimethylbenzanthracene (DMBA)-induced mammary carcinogenesis[J]. Toxicol Lett, 2008, 181(2):87-92.

[11]Tsai CW, Lin CY, Wang YJ. Carnosic acid induces the NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 expression in rat clone 9 cells through the p38/nuclear factor erythroid-2 related factor 2 pathway[J]. J Nutr, 2011, 141(12):2119-2535.

[12]代恩勇，盧振霞，史潔萍，等.NQO1基因多態性與大腸癌遺傳易感性[J]. 中國腫瘤臨床, 2004, 31(2):89-91.

[13]Fagerholm R, Hofstetter B, Tommiska J, et al. NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 NQO1*2 genotype (P187S) is a strong prognostic and predictive factor in breast cancer[J]. Nat Genet, 2008, 40(7):844-853.

[14]楊 洋，金鐵峰，劉雙萍，等. 醌氧化還原酶過表達在頭頸部鱗狀細胞癌預后評估中的意義[J]. 中華病理學雜志, 2014, 43(7):463-467.

[15] Awadallah NS, Dehn D, Shah RJ, et al. NQO1 expression in pancreatic cancer and its potential use as a biomarker[J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2008, 16(1):24-31.

(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Prognostic significance of NAD(P)H-quinone oxidoreductase 1 overexpression in ovarian mucinous cystadenocarcinoma

XU Ming1, YANG Yang1, CHE Shuan-long1, PIAO Ying-shi2, LIN Zhen-hua1,2, CHEN Li-yan2

(1DepartmentofPathology，MedicalCollege,2CancerResearchCenter,YanbianUniversity,Yanji133002,China.E-mail:lychen@ybu.edu.cn)

AIM: To investigate the significance of NAD(P)H-quinone oxidoreductase 1 (NQO1) protein overexpression for prognostic evaluation of ovarian mucinous cystadenocarcinoma.METHODS: NQO1 protein was detected in 162 cases of ovarian mucinous cystadenocarcinoma, 35 cases of ovarian mucinous cystadenoma and 29 samples of normal ovarian epithelial tissues by the method of EnVision immunohistochemical staining. The correlation between high expression of NQO1 protein and clinicopathological features of ovarian mucinous cystadenocarcinoma was also evaluated. Overall survival and disease-free survival rates of ovarian mucinous cystadenocarcinoma patients were calculated by Kaplan-Meier method. RESULTS: The positive rate and strongly positive rate of NQO1 protein were 85.8% and 64.2% in ovarian mucinous cystadenocarcinoma, respectively, which are significantly higher than those in ovarian mucinous cystadenoma, and normal ovarian epithelial tissues (P<0.01). NQO1 expression was significantly correlated with the histological grade (P<0.05) and clinical stage (P<0.01) of ovarian mucinous cystadenocarcinoma. Kaplan-Meier survival analysis showed that the overall survival rate and disease-free survival rate were significantly higher in ovarian mucinous cystadenocarcinoma patients with high NQO1 expression than those with low NQO1 expression (P<0.01).CONCLUSION: NQO1 expression is closely correlated with the progression and prognosis of the patients with ovarian mucinous cystadenocarcinoma. High expression of NQO1 protein may be used as an important indicator for the patients with poor prognosis of ovarian mucinous cystadenocarcinoma.

Ovarian mucinous cystadenocarcinoma; NAD(P)H-quinone oxidoreductase 1; Immunohistochemistry; Disease-free survival; Prognosis

1000- 4718(2016)08- 1461- 05

2016- 03- 03

2016- 06- 15

國家自然科學基金資助項目(No. 81460399)

R730.23； R737.31

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.021

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