右歸丸對腎陽虛證患者TLR4/MyD88/NF-κB信號通路表達的影響

譚從娥，馮文哲，陳金妍，楊　飛

(陜西中醫藥大學,陜西 咸陽 712046)

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論著

右歸丸對腎陽虛證患者TLR4/MyD88/NF-κB信號通路表達的影響

譚從娥，馮文哲，陳金妍，楊飛

(陜西中醫藥大學,陜西 咸陽 712046)

[摘要]目的探討右歸丸治療腎陽虛證的免疫調控機制。方法篩選9例腎陽虛證患者,均給予右歸丸口服，連服1個月。分別于治療前后采集患者外周靜脈血，制備外周血單個核細胞(PBMC)，提取RNA，按照實時定量PCR(qPCR)實驗流程，檢測TLR4、MyD88及NF-κBmRNA表達情況，并進行比較分析。結果治療后，患者TLR4mRNA表達水平明顯下調(P<0.05)，MyD88、NF-κB mRNA表達水平均明顯上調(P均<0.05)。結論右歸丸可以調節TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的表達，這可能是右歸丸良性調節腎陽虛證免疫功能的分子機制之一。

[關鍵詞]腎陽虛證；右歸丸；TLR4/MyD88/NF-κB信號通路；實時定量PCR

腎陽虛證存在著免疫功能紊亂，這一結論已經被不同層次的實驗研究所證實[1-2]。Toll受體(Toll-like receptor，TLR)信號通路在自身免疫中有重要作用，是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁[3]，與中醫腎的免疫功能有著千絲萬縷的聯系。右歸丸是臨床治療腎陽虛證最常用的代表方劑，其可通過調控免疫細胞、免疫基因以及細胞內信號傳遞通路等而發揮治療作用[4]。因此筆者推測，對TLR信號通路的調節作用可能是右歸丸良性調節腎陽虛證免疫功能失衡的分子機制之一。為了驗證此假說，本研究通過實時定量PCR(qPCR)技術，分析TLR4介導的MyD88/NF-κB信號通路在腎陽虛證患者經右歸丸治療前后的表達情況，為右歸丸良性調節腎陽虛證免疫功能失衡提供分子生物學證據。

1臨床資料

1.1一般資料選擇在陜西中醫藥大學附屬醫院男科門診就診且治療顯效的腎陽虛證患者9例，均無器質性疾病，年齡35～48(42.67±4.52)歲。中醫臨床表現以腰膝酸痛、畏寒肢冷、尺脈不足為主癥，兼癥有精神不振、性欲減退、腰背發冷、夜尿頻多等，參照文獻[5]所載腎陽虛證辨證因子評分細則，9例患者均具備主證4項，兼證3項以上，定性定量積分>18分，為典型的腎陽虛證。所有受試者均簽署知情同意書，實驗過程獲得陜西中醫藥大學附屬醫院倫理委員會審批。

1.2試劑和儀器反轉錄試劑盒購自Fermentas公司，rTaq酶及配套試劑購自TAKARA公司，SYBR Green Realtime PCR Master Mix(DRR041A)購自TAKARA公司；普通PCR儀為ABI 9700型PCR擴增儀，定量PCR儀為ABI 7500 FAST型熒光定量PCR儀。

1.3方法

1.3.1治療方法及療效評定患者均給予右歸膠囊(江西銀濤藥業有限公司生產，國藥準字Z20030134，批號：1504014)口服，每次2粒，每天2次，空腹連服1個月。治療前后分別按照腎陽虛證辨證因子評分細則對9例患者進行評分，治療后證候積分減少≥70%為顯效。積分減少率=(治療前積分-治療后積分)/治療前積分×100%。

1.3.2提取外周血單個核細胞(PBMC)分別于治療前后采集患者外周血10 mL，EDTA抗凝，無菌條件下Ficoll液常規方法分離PBMC，每管加入0.5 mL Trizol試劑，充分抽打、混勻，置于-80 ℃以下凍存以備RNA的制備。

1.3.3qPCR法檢測TLR4、MyD88及NF-κBmRNA表達水平將純化的PBMC,根據Trizol Regent 的操作步驟,提取總RNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性與純度,要求能夠清晰呈現28S、18S條帶,OD260/OD280比值介于1.8～2.0之間。取總RNA 20～50 μg，去除RNA基因組，按步驟合成cDNA第一鏈。采用SYBEGREEN qPCR法檢測TLR4、MyD88及NF-κB mRNA表達水平，內參基因為18S rRNA。PCR引物信息見表1。參照說明書設定PCR程序，95 ℃10 min變性，然后95 ℃ 15 s，60 ℃30 s，重復40個循環進行擴增。反應結束，設定最佳閾值，獲取Ct(threshold cycle)值，根據儀器給出的標準曲線和斜率，獲得目的基因的相對表達指數。

表1　各目的基因的引物序列及產物大小

注：①為內參照基因。

1.4統計學方法數據采用SPSS 15.0統計軟件進行處理，結果以表示。采用相對定量法[6]分析各目的基因mRNA相對表達水平。以18S rRNA作為內參照基因，計算各目的基因在每個樣本的ΔCt(ΔCt = Ct目的基因-Ct18S rRNA)值，采用配對t檢驗方法比較各目的基因mRNA治療前后表達差異。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1各樣本RNA質控圖各樣本提取出的RNA經紫外分光光度計測定吸光度，每個樣品OD260/OD280均>1.7，RNA經瓊脂糖凝膠電泳顯示28S和18S條帶清晰，質檢結果合格。電泳圖見圖1。

圖1　治療前后各樣本RNA電泳圖

2.2擴增曲線和溶解曲線通過對TLR4、MyD88、NF-κB及管家基因18S rRNA的溶解曲線分析發現，每條目的基因都有單一的Tm(DNA溶解溫度)值，相應地出現一個單一的吸收峰，表明實驗中PCR產物的均一性良好，各基因的擴增具有特異性。擴增曲線及溶解曲線見圖2～9。

圖2　18S的擴增曲線

圖4　TLR4的擴增曲線

圖5　TLR4的溶解曲線

圖6　MyD88的擴增曲線

圖7　MyD88的溶解曲線

圖8　NF-κB的擴增曲線

圖9　NF-κB的溶解曲線

2.3治療前后各通路基因mRNA的表達差異治療后，患者TLR4mRNA表達水平明顯下調(P<0.05)，MyD88、NF-κBmRNA表達水平均明顯上調(P均<0.05)。見表2。

表2　治療前后各目的基因mRNA相對

注：①與治療前比較，P<0.05。

3討論

腎為先天之本，正氣之根，決定先天稟賦的強弱，關系到正氣的盛衰，具有調整和維持機體免疫平衡的重要作用。腎蘊涵腎陰和腎陽，二者協調平衡，則處于“陰平陽秘”狀態，表現為機體的自我調節能力、適應環境能力、抗邪防病能力和康復自愈能力等的正常。這和強調人體“防御、自穩和監視”三大功能的現代醫學免疫理論是一致的。如果腎陽虧虛，陰陽失調，則機體的免疫穩態失衡。免疫穩態的維持需要一系列免疫分子的信息傳遞和整合，信號通路則是實現這些生物學過程的重要路徑。TLR/MyD88通路是一條介導天然免疫反應的重要信號轉導通路。因此，借助經典免疫信號通路TLR4介導的MyD88/NF-κB信號通路研究和腎陽虛證方證相應的右歸丸的療效機制具有確切的理論依據。

選擇典型病例是影響實驗結果的關鍵因素之一。在臨床病例的采集中，本研究采取了腎陽虛證四診癥狀調查表計分和專家診斷相結合的方法，首先根據腎陽虛證辨證因子評分量表在門診對患者進行調查表計分初篩，然后再由中醫臨床專家診斷確定并跟蹤觀察右歸丸臨床療效。經過療效評定篩選了9例達到顯效的患者作為qPCR實驗檢測對象，結果發現，治療后患者TLR4mRNA表達水平明顯下調，MyD88、NF-κB mRNA表達水平均明顯上調，提示右歸丸可以調控腎陽虛證TLR4/MyD88/NF-κB通路基因的表達。

生物體內的信息傳遞和整合是由細胞內外的受體和信號轉導系統來完成的，不同的信號通路之間存在相互的聯系和作用[7]。TLR/MyD88通路是一條介導天然免疫反應的重要信號轉導通路，TLRs激活后通過依賴MyD88和非依賴MyD88信號轉導途徑,最終引起核因子NF-κB活化、炎性反應因子分泌增加[8]。研究證明該通路的異常與腎陽虛證的發生發展密切相關[9]。本研究通過對腎陽虛證經右歸丸治療前后該通路基因的表達比較，也證實了此結論，說明腎陽虛證存在著免疫功能紊亂，且右歸丸可以糾正腎陽虛證免疫紊亂狀態，而對TLRs信號通路的調節作用可能是這種糾正作用的分子機制之一。本研究從免疫信號通路角度揭示了右歸丸對腎陽虛證的調控機制，為右歸丸治療腎陽虛證的宏觀療效提供了理論依據。

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Effect of Yougui Pills on TLR4/MyD88/NF-κB signal pathway of patients with Kidney-Yang deficiency syndrome

TAN Conge，FENG Wenzhe,CHEN Jinyan,YANG Fei

(Shaanxi University of TCM, Xianyang 712046, Shaanxi, China)

Abstract:Objective It is to discuss the immune regulation mechanism of Yougui Pills on the Kidney-Yang deficiency syndrome. Methods Nine Kidney-Yang deficiency patients were selected for one month treatment with Yougui Pills. Accumulated clinical scores of Kidney-Yang deficiency were assessed pre-treatment and post-treatment using a 40-factor questionnaire. Nine patients were all observed with good therapeutic efficacy and were prepared for Real-time Quantitative PCR (qPCR) tests. 10mL blood were collected to tract Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) for each patients pre-treatment and post-treatment with Yougui Pills. With the RNA from PBMC, we did qPCR tests to detect mRNA expressed value of three target genes of TLR4, MyD88 and NF-κB. Results TLR4, MyD88 and NF-κB genes of Kidney-Yang deficiency patients were significantly expressed after treated by Yougui Pills, the TLR4 gene was down regulated while the MyD88 and NF-κB gene was up regulated. Conclusion Yougui Pills could regulate the expression of TLR4/MyD88/NF-κB signal pathway, which may be one of the molecular mechanisms for Yougui Pills to regulate the immune function of Kidney-Yang deficiency syndrome.

Key words:Kidney-Yang deficiency syndrome; Yougui Pill; TLR4/MyD88/NF-κB signal pathway; real-time quantitative PCR

[收稿日期]2015-12-30

[中圖分類號]R-33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)14-1483-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.14.001

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(81473559)；陜西省教育廳自然科學專項課題(2013JK0821)；咸陽市科技局項目(2012K16-02)

[作者簡介]譚從娥，女，副教授，從事中醫診斷學研究。