復榮通脈膠囊對糖尿病大鼠心肌TGF-β1及CTGF表達水平的影響研究

屈會云，王立新

(河北醫科大學附屬滄州中西醫結合醫院，河北 滄州 061001)

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復榮通脈膠囊對糖尿病大鼠心肌TGF-β1及CTGF表達水平的影響研究

屈會云，王立新

(河北醫科大學附屬滄州中西醫結合醫院，河北 滄州 061001)

[摘要]目的觀察經驗方復榮通脈膠囊對糖尿病大鼠心肌轉化生長因子β1(TGF-β1)、結締組織生長因子(CTGF)的影響，探討其對糖尿病心肌病的可能作用機制，為臨床防治糖尿病心肌病提供可靠的實驗依據。方法將雄性Wistar大鼠88只隨機分為正常組、模型組、復榮通脈膠囊低劑量組及復榮通脈膠囊高劑量組，每組22只。除正常組外，其余組均采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)的方法建立糖尿病大鼠模型。造模成功后，復榮通脈膠囊低劑量組和高劑量組分別給予復榮通脈膠囊混懸液0.67 g/(kg·d)和1.34 g/(kg·d)灌胃，正常組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃。連續灌胃8周后，測量各組體質量、血糖、TC、TG，免疫組化法檢測心肌組織中TGF-β1、CTGF表達情況。結果灌胃8周后，正常組體質量明顯高于灌胃前(P<0.05)，模型組和復榮通脈膠囊低劑量組、高劑量組體質量均明顯低于灌胃前及正常組(P均<0.05)；各組血糖水平與灌胃前比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，模型組和復榮通脈膠囊低劑量組、高劑量組比較差異也均無統計學意義(P均>0.05)；各組間TC比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，模型組TG明顯高于正常組(P<0.05)，復榮通脈膠囊低劑量組、高劑量組TG與模型組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；復榮通脈膠囊高劑量組心肌組織中TGF-β1、CTGF表達水平明顯低于模型組和復榮通脈膠囊低劑量組(P均<0.05)。結論復榮通脈膠囊可下調TGF-β1、CTGF在糖尿病大鼠心肌組織中的表達，從而發揮其對糖尿病心肌病的治療作用，但具有劑量依賴性。

[關鍵詞]糖尿病心肌?。粡蜆s通脈膠囊；轉化生長因子β1；結締組織生長因子

糖尿病心肌病(diabetio cardio myopathy，DCM)是糖尿病的微血管病變之一，亦是導致糖尿病患者死亡的重要原因之一。有研究顯示補陽還五湯對糖尿病有治療作用[1]，且加味補陽還五湯能夠改善糖尿病患者的微循環障礙[2]。我院制劑復榮通脈膠囊是在補陽還五湯的基礎上加減化裁而成，在臨床應用中可明顯改善糖尿病心肌病患者胸悶、憋氣癥狀，提高左室射血分數，但作用機制尚未明確。本實驗通過觀察復榮通脈膠囊對糖尿病心肌病發生發展過程中起著極為關鍵作用的轉化生長因子β1(TGF-β1)、 結締組織生長因子(CTGF)的影響，探討復榮通脈膠囊可能的作用機制及作用靶點，為防治糖尿病心肌病提供科學、客觀的實驗依據?，F將結果報道如下。

1實驗資料

1.1實驗動物88只健康雄性Wistar大鼠，體質量180～210 g，由北京維通利華生物有限公司提供，動物合格證號：11400700005601，單位許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2試劑鏈脲佐菌素(STZ)、檸檬酸鈉(美國Sigma公司)，TGF-β1、CTGF免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。復榮通脈膠囊含水蛭、全蝎、地龍、當歸、黃芪、玄參、川牛膝、葛根、首烏藤、甘草、穿山龍，院內制劑，批準文號：冀藥制字Z20070041，生產批號：130301，規格：每粒0.5 g，相當于生藥2 g。使用時按比例加蒸餾水制成混懸液。

1.3實驗方法

1.3.1動物分組及造模將88只雄性Wistar大鼠隨機分為正常組、模型組、復榮通脈膠囊低劑量組及復榮通脈膠囊高劑量組，每組22只。適應性飼養10 d后準備造模，所有大鼠于造模前禁食12 h。參照文獻[3]方法，各造模組均予腹腔一次性注射1% STZ(臨用前將STZ溶于0.1 mol/L、pH 4.2的無菌檸檬酸緩沖液中，10 min內用完)60 mg/kg，正常組一次性腹腔注射等容量檸檬酸緩沖液。造模72 h后，尾靜脈取血測量血糖值，血糖值≥16.7 mmol/L確定為造模成功。造模過程中大鼠無死亡，血糖值未達標10只棄去不用，最后納入觀察的大鼠正常組22只，模型組18只，復榮通脈膠囊低劑量組、高劑量組各19只。

1.3.2給藥方法造模成功后24 h開始給藥。參考《藥理實驗方法學》，按人體-大鼠體表面積比值表換算出大鼠的等效劑量，復榮通脈膠囊低劑量組和高劑量組分別給予復榮通脈膠囊混懸液0.67 g/(kg·d)和1.34 g/(kg·d)灌胃，正常組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃。大鼠灌胃容量10 mL/(kg·d)，連續8周。實驗階段大鼠進標準飲食，自由飲水，實驗室溫度控制在(24±2)℃，實驗過程中各組均未使用其他任何藥物。

1.3.3標本留取方法灌胃8周后，所有大鼠空腹稱體質量，尾靜脈取血測血糖。接著以3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈采血2 mL置于不抗凝管，分離血清，用日立7600-010全自動生化分析儀檢測TC、TG。然后開胸取出心臟，冰生理鹽水沖洗，濾紙吸干，取心尖部心肌，切成2 mm×2 mm×2 mm左右的組織塊，放入盛有4%中性甲醛固定液的小瓶內, 送病理室行TGF-β1、CTGF免疫組化檢測。

1.3.4免疫組化測定方法石蠟切片厚4 μm，常規脫蠟至水；將切片置于3%過氧化氫甲醇溶液中，室溫震蕩約15 min以封閉內源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗2次，每次5 min；采用微波修復法進行抗原修復。之后用0.01 mol/L PBS洗2次，每次5 min；加入正常山羊血清，溫度37 ℃，30 min以封閉內源性生物素；將血清甩掉，加一抗，4 ℃過夜。再次用0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min；滴加二抗，37 ℃，25 min。繼續用0.01 mol/L PBS連續沖洗3次，每次5 min，然后滴加辣根酶標記鏈霉卵白素(SP)，37 ℃，20 min。接著用0.01 mol/L PBS沖洗4次，每次5 min。用新配制的DAB液顯色，在光鏡下控制顯色程度；最后用蒸餾水沖洗、終止顯色。蘇木素輕度復染，脫水、封片。

1.3.5結果判定免疫組化結果用HMIAS-2000高清晰度彩色醫學圖文分析系統分析，TGF-β1陽性表達主要在大鼠心肌細胞胞質，CTGF陽性表達主要在大鼠心肌間質細胞，兩者在血管周圍也可出現陽性表達。鏡下隨機選擇5～10個視野，計數100～200個細胞，胞漿黃染為陽性。染色判定用二級計分法，即根據陽性細胞染色強度及陽性細胞百分數分級，最后以二者分數之和作為最終結果。陽性細胞計數<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；無著色0分，淡黃色1分，黃或深黃色2分，褐或棕褐色3分。

2結果

2.1實驗動物數量分析實驗過程中死亡9只，最終正常組22只，模型組16只，復榮通脈膠囊低劑量組15只，復榮通脈膠囊高劑量組16只。

2.2各組大鼠灌胃前后體質量變化情況各組大鼠灌胃前體質量比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。灌胃8周后，正常組體質量明顯高于灌胃前(P<0.05)，模型組和復榮通脈膠囊低劑量組、高劑量組體質量均明顯低于灌胃前及正常組(P均<0.05)。見表1。

2.3各組大鼠灌胃前后血糖變化情況灌胃前模型組、復榮通脈膠囊低劑量組和高劑量組大鼠血糖水平均明顯高于正常組(P均<0.05)；灌胃8周后，各組血糖水平與灌胃前相比差異均無統計學意義(P均>0.05)，模型組、復榮通脈膠囊低劑量組和高劑量組組間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

2.4各組大鼠灌胃后血清TG、TC比較各組間TC比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，模型組TG明顯高于正常組(P<0.05)，復榮通脈膠囊低劑量組、高劑量組TG與模型組和正常組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表3。

表1　各組大鼠灌胃前后體質量變化情況±s，g)

注：①與灌胃前比較，P<0.05；②與正常組比較，P<0.05。

表2　各組大鼠灌胃前后血糖變化情況±s，mmol/L)

注：①與正常組比較，P<0.05。

表3　各組大鼠灌胃后血清TG、TC比較

注：①與正常組比較，P<0.05。

2.5各組大鼠心肌組織中TGF-β1、CTGF表達情況TGF-β1在正常組大鼠心肌細胞胞質中呈弱陽性表達；模型組大鼠心肌細胞胞質及血管周圍出現較多棕黃色顆粒物質，呈強陽性反應；復榮通脈膠囊高劑量組大鼠心肌細胞胞質及血管周圍棕黃色顆粒較模型組大鼠明顯較少、減弱，而復榮通脈膠囊低劑量組與模型組比較TGF-β1陽性表達未見明顯減弱。CTGF在正常組大鼠心肌間質細胞及血管周圍可見少許淡黃著色；模型組大鼠心肌間質細胞及血管平滑肌細胞可見大量棕黃色顆粒物質，呈強陽性反應；復榮通脈膠囊高劑量組大鼠心肌間質棕黃色物質較模型組明顯減少、減弱，而復榮通脈膠囊低劑量組與模型組比較CTGF陽性表達未見明顯變化。見圖1～8及表4。

3討論

TGF-β1是一種多效性細胞因子,其重要作用是調節細胞外基質的產生和降解。研究發現，在STZ誘導的糖尿病成模后6周血清和心肌局部的TGF-β1水平即明顯增加，且隨時間延長逐漸增高[4]。鐘明等[5]研究發現糖尿病心肌病大鼠左室心肌組織膠原含量、TGF-β1蛋白質表達水平明顯升高,存在心肌間質纖維化。經TGF-β1抗體干預后，TGF-β1的活性被抑制，轉化生長因子水平及心肌膠原含量隨之下降，心肌纖維化減輕[6]。顯示TGF-β1參與了糖尿病心肌病心肌細胞肥大、心肌間質纖維化的發生、發展。

圖1　正常組心肌組織中TGF-β1 表達情況(×400)

圖2　模型組心肌組織中TGF-β1表達情況(×400)

圖3　復榮通脈膠囊低劑量組心肌組織中TGF-β1表達情況(×400)

圖4　復榮通脈膠囊高劑量組心肌組織中TGF-β1 表達情況(×400)

圖5　正常組心肌組織中CTGF表達情況(×400)

圖6　模型組心肌組織中CTGF表達情況(×400)

圖7　復榮通脈膠囊低劑量組心肌組織中CTGF表達情況(×400)

圖8　復榮通脈膠囊高劑量組心肌組織中CTGF表達情況(×400)

組別nTGF-β1CTGF正常組221.50±1.061.59±1.10模型組164.56±1.26①②4.44±1.36①②復榮通脈膠囊低劑量組154.47±1.19①②4.13±1.68①②復榮通脈膠囊高劑量組162.00±1.211.63±1.09

注：①與正常組比較，P<0.05；②與復榮通脈膠囊高劑量組比較，P<0.05。

CTGF是一種致纖維化生長因子。研究發現,在STZ誘導的糖尿病大鼠和小鼠心室中CTGF表達明顯增高，并且隨著病程的進展，CTGF 呈持續增高，細胞外基質蛋白、成纖維細胞合成的膠原蛋白增加，心肌細胞肥大，證明CTGF參與了糖尿病心肌病的發生、發展[7]。

中醫學中并無“糖尿病心肌病”的病名，但根據其發病特點和常見證候，屬中醫“心悸”“怔忡”“胸痹”“厥心痛”等范疇。多數學者認為，“瘀”貫穿了其發生發展的全過程。復榮通脈膠囊方專為消渴心脈瘀阻、氣陰不足而設，方中水蛭、全蝎、地龍化瘀、通絡、熄風;黃芪、當歸益氣養血，補固正氣；玄參、葛根養陰生津；川牛膝化瘀而引血下行；穿山龍活血而暢通經脈。該方補通結合，潤活相滋，使正氣存，邪氣散，共達復榮通脈之功。

本實驗結果顯示，灌胃8周后，模型組大鼠體質量、血糖、血脂與復榮通脈膠囊高、低劑量組相比差異均無統計學意義，提示復榮通脈膠囊對糖尿病心肌病的治療不是通過降低體質量、調節糖脂代謝發揮作用的。而復榮通脈膠囊高劑量組心肌組織中TGF-β1、CTGF表達水平明顯低于模型組和復榮通脈膠囊低劑量組，提示復榮通脈膠囊能夠下調TGF-β1、CTGF在糖尿病心肌組織的表達，從而發揮其對糖尿病心肌病的治療作用，但具有劑量依賴性。在今后的實驗中可將給藥劑量進一步細化，以確定可達到預期療效的劑量。

[參考文獻]

[1]張林軍，劉軍. 補陽還五湯治療2型糖尿病研究進展[J]. 中國實驗方劑學雜志，2012,18(1)：243

[2]金威爾，劉安. 加味補陽還五湯為主治療增殖型糖尿病視網膜病變的臨床研究[J]. 中國中醫眼科雜志，2008,18(5):270

[3]徐淑云，卞如濂，陳修. 藥理實驗方法[M]. 北京：人民衛生出版社，2005：202

[4]李虎英，李興. 轉化生長因子β1在糖尿病心肌病變中作用的研究[J]. 臨床醫藥實踐，2007,16(4):266-268

[5]鐘明,張運,苗雅,等. 纈沙坦逆轉糖尿病心肌病大鼠心肌間質纖維化的作用[J]. 中華醫學雜志,2006,86(4):232-236

[6]Bai S,Cao X. A nuclear antagonistic mechanism of inhibitor ySmadsin transforming growth factor-beta sig naling[J]. J Biol Chem，2002,277(6):4176-4182

[7]Kerrie J,Keiji I,Kiyoshi S,et al. Expression of connective tissue growth factor is increased in injured myocardium associated with proteinkinase C beta2 activation and diabetes[J]. Diabetes，2002,51(9):2709-2718

Experimental study on intervention effects of Furongtongmai capsule on the expression level of myocardial TGF-β1and CTGF in diabetic rats

QU Huiyun ,WANG Lixin

(Cangzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Affiliated to Hebei Medical University, Cangzhou 061001, Hebei, China)

Abstract:Objective It is to observe the intervention effects of Furongtongmai capsule on the expression level of myocardial TGF-β1 and connective tissue growth factor (CTGF) in diabetic rats, and to explore its possible mechanism on diabetic cardiomyopathy. Methods 88 male Wistar rats were randomly divided into four groups: normal control group (NC group), diabetic model control group(DM group), Furongtongmai capsule low-dose (FRL) and high-dose treated(FRH) groups with 22 rats in each group. The diabetic rat models were created by intraperitoneal injection of streptozocin(STZ) in all groups except NC group. After the models were successfully established, FRL group and FRH group were given Furongtongmai capsule 0.67 g/(kg·d) and 1.34 g/(kg·d) respectively by lavage, NC group and DM group were given normal saline by lavage. After treatment for 8 weeks, body weight (BW) was measured, blood glucose (BG), TC and TG were tested with automatic biochemical analyzer, and myocardial TGF-β1 and CTGF were detected by immunoshistochemistry assay. Results After 8 weeks, BW of the rats were higher in NC group while that in DM group and FRL and FRH groups were lower than those before lavage(P>0.05). No significant change of BG was found in every group compared with that before lavage (P>0.05). There was no significant difference in TC and BG among every group (P>0.05), but the level of TG was higher in DM group than that in NC group (P>0.05), no significant difference in TG was found between Furongtongmai capsule treatment groups and DM group(P>0.05). The expression level of TGF-β1 and CTGF in FRH group was lower than that in DM group and FRL group (P<0.05). Conclusion Furongtongmai capsule can down-regulate the expression of TGF-β1 and CTGF in myocardial tissue in DM rats, thus to play its treatment effect on diabetic cardiomyopathy, but dose dependence is also needed.

Key words:diabetic cardiomyopathy; Furongtongmai capsule; TGF-β1; connective tissue growth factor

[收稿日期]2015-10-10

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)14-1495-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.14.005

[作者簡介]屈會云，女，碩士,從事中西醫結合內分泌基礎及臨床研究工作。