慢性膀胱炎相關膀胱過度活動癥大鼠模型的建立

高 峰, 張士更, 張 楠, 張布衣, 戴玉樑, 李紹江

(1. 浙江中醫藥大學第二臨床醫學院, 杭州 310053; 2. 浙江大學醫學院附屬第二醫院泌尿外科, 杭州 310009)

慢性膀胱炎相關膀胱過度活動癥大鼠模型的建立

高 峰1, 張士更2, 張 楠2, 張布衣2, 戴玉樑1, 李紹江1

(1. 浙江中醫藥大學第二臨床醫學院, 杭州 310053; 2. 浙江大學醫學院附屬第二醫院泌尿外科, 杭州 310009)

目的 建立一種發病機制、尿流動力學表現與臨床相近的慢性膀胱炎相關膀胱過度活動癥(OAB)大鼠模型。方法 將40只雌性SD大鼠隨機分為模型組和生理鹽水對照組; 模型組以大腸埃希氏菌膀胱灌注，3 d后搜集尿液常規顯微鏡檢查，證實膀胱炎并以慶大霉素灌胃每日4次，連續7 d，第10日復查尿常規，每隔10 d為1個周期，經4個周期后行尿流動力學檢查及膀胱HE染色病理學檢查。生理鹽水對照組用等量生理鹽水代替大腸埃希氏菌溶液，其余處理同模型組。2組同條件飼養。結果 模型組膀胱標本可見少量上皮組織退變、凋亡、脫落，黏膜固有層見散在的淋巴細胞，行尿流動力學檢查確認13只建模成功。結論 通過大腸埃希氏菌ATCC35218反復膀胱灌注誘導SD大鼠慢性膀胱炎，最終可建立慢性膀胱炎相關OAB大鼠模型，為臨床上常見的膀胱炎后OAB的發病機制及治療、研究提供思路。

慢性膀胱炎; 膀胱過度活動癥(OAB); 大腸埃希氏菌; 大鼠模型

膀胱過度活動癥(overactive bladder, OAB)是泌尿系統常見的慢性疾病, 表現為尿急, 伴或不伴急迫性尿失禁, 可嚴重影響生活質量, 尿流動力學上表現為逼尿肌過度活動(detrusor overactivity, DO)[1]。目前在OAB的動物研究中多以家兔、大鼠制造膀胱出口梗阻(bladder outlet obstruction, BOO), 少數采用腹腔內注射環磷酰胺建立DO模型[2-4]。而臨床上發現, 反復膀胱炎女性患者多并發OAB。因此本實驗通過反復大腸埃希氏菌ATCC35218膀胱內灌注并予慶大霉素灌胃治愈, 探討反復膀胱炎后是否導致OAB？擬通過建立膀胱炎相關OAB動物模型, 為進一步探索臨床上常見的慢性膀胱炎后OAB發病機制及治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF級雌性SD大鼠，40～45日齡，體質量150～180 g, 購自浙江中醫藥大學動物實驗中心[SCXK (浙)2016-0009]。將40只大鼠按隨機數字表法分成2組，模型組(A組, 20只)，生理鹽水對照組(B組，20只)，分籠飼養，自由飲水。

1.2 儀器、試劑與菌種

尿動力檢查儀(荷蘭MMS公司, 型號: MMS Solar), 分光光度計(日本Hitachi公司, 型號: U-0080D), 正置顯微鏡(日本Olympus公司, 型號: CX41)，大腸埃希菌(杭州百思生物技術有限公司,標準標號: ATCC35218)。

1.3 實驗方法

1.3.1 大腸埃希菌溶液的制備 從-70 ℃冰箱取出大腸埃希菌ATCC35218菌種，無菌條件下，挑起菌種用劃線法接種在血平板上，置于37 ℃恒溫，24 h后，挑取大腸埃希菌菌落至試管中，用生理鹽水溶解，分光光度儀測定大腸埃希菌，保持濃度在1×108～1.2×108CFU/mL(接種及培養由浙江中醫藥大學附屬第一醫院檢驗科完成)。

1.3.2 膀胱灌注方法 無麻醉下抓取大鼠，反復擠壓大鼠下腹部直至未見尿液流出。用碘伏連續消毒尿道外口及周圍1 cm皮膚3次，剪去醫用留置針針尖前部約0.5 cm，連接移液槍，灌注100 μL大腸埃希菌至膀胱內，保持3 min后將大鼠放回籠中正常飼養。

1.3.3 各組處理方法 A組大鼠膀胱內灌注大腸埃希菌ATCC35218(1×108～1.2×108CFU/mL) 100 μL, 3 d后搜集尿液常規顯微鏡檢查，后予慶大霉素(0.5 mL，2萬單位)灌胃每日4次，連續7 d進行治療，第10日復查尿常規，如此10 d為1個周期，共4個周期后行尿流動力學檢查，并取膀胱標本行HE染色。B組用同等量生理鹽水代替大腸埃希氏菌溶液，其余處理方法同模型組。2組同條件飼養。

1.3.4 DO檢測及判定方法 將質量分數2%戊巴比妥以35 mg/kg腹腔注射，10 min后同膀胱灌注法常規消毒，尿道外口插入外徑1 mm 軟質硬膜外麻醉管入膀胱，經三通裝置連接微量灌注泵與尿動力學檢查儀，輕壓腹部至排凈尿液。膀胱灌注液采用37 ℃生理鹽水，速度為0.05 mL/min，從灌注開始到排尿時停止。每只大鼠檢測4次。若膀胱充盈期逼尿肌不穩定收縮波存在且2次及以上，則判定為陽性，即DO或OAB。若不穩定收縮波只出現1次，則第2日再次行尿動力檢測，仍在1次及以下判定為陰性。

1.3.5 尿常規及病理檢測 在各組大鼠尿流動力學檢測結束后, 頸椎脫臼法處死, 迅速剪開下腹部皮膚,暴露膀胱, 用0.5 mL針筒抽取全部尿液, 離心沉淀后高倍鏡鏡檢，以+(陽性，白細胞數＞5個/每高倍鏡視野)或－(陰性, 白細胞數0～5個/每高倍鏡視野)表示。取2組大鼠的膀胱組織固定后, 行常規組織切片, HE染色, 若A組大鼠出現DO的同時切片鏡檢膀胱上皮組織未見細菌菌落，上皮組織基本完好且未見大量炎癥細胞浸潤, 表明造模成功。1.4 統計學方法

將數據整理后錄入EXCEL中，分析時讀入SPSS19.0中進行數據分析，各組間采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大體觀察

A組大鼠在大腸埃希菌灌注期間死亡2只, 慶大霉素灌胃期間死亡1只; B組在灌胃期間死亡2只，死亡大鼠均在處理后第2日發現。灌胃時個別大鼠在進針、推藥時掙扎明顯，放回籠中后略顯虛弱及疲態，對刺激反應較差，可見類嘔吐表現，第2日大鼠口腔中發現陳舊性血跡，考慮可能因操作不當至消化道穿孔或誤注入氣管引起。A、B組膀胱灌注后觀察，A組個別大鼠趴在籠中類似寒戰表現，偶見小范圍跑動的異常興奮表現，可能此時已出現感染性休克初期表現。

2.2 尿流動力學檢測

在測量前將膀胱內壓、腹壓以及逼尿肌壓力均設為0 cmH2O。A組膀胱充盈期不穩定收縮波明顯增多，排尿時間明顯(圖1A); B組以出現一逼尿肌正常排尿的收縮波為主(P＜0.05)。此外，觀察到首次收縮波出現時間也較B組提前(圖1B)。

圖1 大鼠尿流動力學排尿期收縮波

表1 各組大鼠膀胱充盈期不穩定收縮及4次尿白細胞陽性率比較

2.3 尿常規檢查

4次尿常規白細胞檢測: A組大腸桿菌膀胱灌注3 d后白細胞陽性率均為100%，治療后陽性率在11.8%以下; B組膀胱灌注及治療后陽性率在5.6%以下。A、B組膀胱尿流動力學檢測陽性占比分別為76.5%、5.6%(表1)。這一現象符合臨床治愈診斷且A、B組大鼠膀胱炎患病率出現差異(P＜0.05)。

圖2 各組大鼠膀胱上皮病理學觀察(HE×400)

2.4 膀胱組織學檢查

A組死亡大鼠膀胱組織切片鏡檢可見上皮組織大量脫落，大量桿菌分布于黏膜，血管周圍有菌落成團出現(圖2A); A組大鼠治療4個周期后膀胱上皮可見少量黏膜上皮退變、壞死、凋亡、脫落，較B組變薄，黏膜固有層輕微水腫, 出現散在淋巴細胞(圖2B), 共13只大鼠造模成功, 成功率76.5%。B組大鼠鏡下可見黏膜上皮完好，偶見凋亡脫落，未見大量炎癥細胞及水腫形成(圖2C)。

3 討論

OAB目前已成為泌尿外科常見病, 在我國總體發病率約為6%, 40周歲以上人群發病率高達11.3%,其中男性約占5%，女性約占6%，隨年齡增長發病率增高[5]。預計到2018年，全球范圍約有5.46億OAB患者。在部分西方國家OAB已成為十大常見慢性病之一，嚴重影響患者身心健康和工作，日益成為家庭及社會的沉重負擔[6]。其發病機制尚不清楚，目前主要認為有兩種機制，神經源性學說與肌源性學說，其中肌源性學說因Cajal 間質細胞的發現被廣泛認可[7,8]。

膀胱炎多見于女性患者，以上行性感染多見。分為急性膀胱炎和慢性膀胱炎，臨床上多見于慢性膀胱炎，約85%均由大腸埃希菌引起，其次為葡萄球菌，變形桿菌等。慢性膀胱炎由于膀胱感覺過敏，可出現尿頻尿急等逼尿肌過度活動(DO)癥狀[5,9]。但經抗生素治療尿常規白細胞陰性后，部分患者仍有DO癥狀; 其發病機制是由于膀胱炎并未真正治愈，還是反復膀胱炎癥繼發OAB等引起?目前國內外未見相關報道。

本實驗通過大鼠膀胱內反復灌注大腸埃希菌建立慢性膀胱炎并以尿常規檢測確認。在慶大霉素治療至尿白細胞陰性后再行尿動力學檢測。同時予膀胱HE染色鏡檢明確膀胱炎治愈情況，從而排除因膀胱炎直接引起DO癥狀的可能性。因雄性大鼠尿液可由輸精管返流入精囊，改變膀胱內壓，在尿流動力學檢查過程中影響膀胱功能的評估，因此本實驗全部采用雌性大鼠。

實驗中， A組大鼠在灌注大腸埃希菌期間死亡2只，將死亡大鼠取出膀胱行HE染色，見大量上皮脫落，血管擴張充血，血管內見大量菌落成團。考慮可能由于尿路感染最終引起敗血癥、感染性休克而死亡。灌胃期間3只大鼠死亡，考慮主要為操作不當引起：灌胃致消化道穿孔或注射入呼吸道。A組在尿動力學檢測中，膀胱充盈期不穩定收縮波較B組陽性率明顯升高，具有統計學意義，表明造模成功，且逼尿肌收縮的時間早于B組，這一現象可能因膀胱感覺過敏引起。而A組仍有23.5%的大鼠尿動力學檢測為陰性，分析原因:①所有大鼠均在麻醉過程中檢測，由于麻醉可抑制逼尿肌的自發收縮活動和排尿反射，因此會出現一定概率的假陰性; ②膀胱炎病程較短，部分大鼠未能夠造成病理生理改變，從而未引起DO。

目前在國內外OAB的動物研究中, 多數采用家兔、大鼠, 通過對尿道進行結扎、放置金屬環等不同手段, 增加尿道排尿阻力, 從而模擬老年男性前列腺增生引起的DO模型[2,3]。而臨床上女性患者OAB的產生多因反復慢性膀胱炎引起，并非長期的后尿道梗阻。本實驗首次通過慢性膀胱炎為誘因建立DO模型。慢性膀胱炎造模參考既往文獻[10,11], 采用大腸埃希菌膀胱內灌注, 濃度為1.2×108CFU/mL，通過該方法，可以成功建立慢性膀胱炎大鼠模型。然后，在該模型的基礎上進一步建立DO模型。

臨床上OAB的治療并不理想，通過行為治療，口服藥物治療等方法雖有一定療效，但仍不能完全治愈，且長期用藥易出現耐受[5]。因此，OAB的基礎研究仍期待新的突破。過去的研究表明: 在BOO引起OAB的動物模型發現: 膀胱肌層內存在Cajal細胞(ICC細胞)，該細胞具有自發性電位，逼尿肌過度活動的逼尿肌中ICC細胞數量明顯增加，細胞網絡化更加明顯[12]。本文提供了一種新的大鼠OAB模型建立方法，為進一步研究慢性膀胱炎與OAB以及膀胱炎后OAB與Cajal 間質細胞的相關性提供了動物實驗基礎，為膀胱炎相關OAB臨床疾病預防和治療提供新的思路。

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Establishment of Over Active Bladder Model Associated with Chronic Cystitis in Rat

GAO Feng, ZHANG Shi-geng, ZHANG Nan, ZHANG Bu-yi, DAI Yu-liang, LI Shao-jiang
(1. The 2nd Clinical Medical College, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China; 2. Department of Urology, The Second Affiliated Hospital Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310009, China)

ObjectiveTo build the over active bladder (OAB) related to chronic cystitis model which is similar to clinical process including pathogenesis and urodynamic performance.MethodsForty female SD rats were randomly divided into model group and saline control group. Model group: the bladders were instilled with Escherichia coli ATCC35218 (1×108～1.2×108CFU/mL) 100 μL, and a urine test were done after 3 days to confirm cystitis. The rats were given by gavage with Gentamicin (0. 5 mL, 2 million units) 4 times a day × 7 days and urine were retested 10 days a cycle. The rats were done urodynamics and HE staining for bladder tissue after 4 cycles. Saline control group: were given by gavage with the same amount of saline solution instead of Escherichia coli, the remaining process was the same as the model group. The animals were raised under the same conditions.ResultsA small amount of epithelial was found degeneration, apoptosis, loss, and scattered lymphocytes in the lamina propria in model group. Thirteen rats were successfully modeled.ConclusionThe OAB animal model can be established after cystitis by repeated E.coli infusion into bladder of female SD rats’. It offers ideas for pathogenesis, treatment and research about OAB associated with chronic cystitis.

Chronic cystitis; Overactive bladder (OAB); Escherichia coli; Rat model

Q95-33

A

1674-5817(2016)05-0340-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.05.003

2016-05-26

浙江省中醫藥科技計劃項目(2012ZA058)

高 峰(1990-), 男, 碩士研究生。

E-mail: 934563340@qq.com

張士更(1973-), 男, 主任醫師。

E-mail: 22676251@qq.com