不同粒徑聚酯底物的微生物降解

王宏陽， 鞏繼賢， 李輝芹， 李 政， 李秋瑾， 張健飛

(1. 天津工業大學 紡織學院， 天津 300387；2. 天津工業大學 先進紡織復合材料教育部重點實驗室， 天津 300387)

不同粒徑聚酯底物的微生物降解

王宏陽1,2， 鞏繼賢1,2， 李輝芹1,2， 李 政1,2， 李秋瑾1,2， 張健飛1,2

(1. 天津工業大學 紡織學院， 天津 300387；2. 天津工業大學 先進紡織復合材料教育部重點實驗室， 天津 300387)

為研究形態結構對高聚物底物生物反應性的影響，分別以不同粒徑的聚酯粉末為唯一碳源培養菌種，通過檢測菌株生物量、發酵液中產物種類與濃度以及聚酯底物結晶度變化，研究菌株對底物尺寸結構的生物反應性影響。結果表明：以粒徑小的粉末作為底物時，菌株的生長速率和生物量都遠大于底物粒徑較大的情況；在培養過程中，不同粒徑底物發酵液中產物種類不盡相同，產物濃度的變化規律不同；菌株更易降解小粒徑顆粒，且主要作用于無定形區域。

生物催化； 聚酯； 粒徑； 生物反應性

聚酯(PET)織物具有良好的洗可穿特性，在紡織服裝行業被廣泛應用，但由于疏水、導濕性差導致服用時悶熱、不舒適，也限制了其在生物醫學、生物工程組織上的應用[1-2]。采用生物加工方法實現聚酯親水性能的提升成為近幾年研究熱點，但與聚酯有關的生物加工研究一直進展緩慢，高效生物催化劑的缺乏是重要的制約因素[3]。最初，人們擬從可催化酯鍵的脂肪酶(Lipase)、酯酶(Esterase)等已商品化酶中，篩選可用于催化PET水解的酶[4-5]，由于效果不理想，又轉而從環境中進行有關微生物的篩選與分離[6-7]。至今，PET分解菌的篩選基本是以PET單體模擬物為底物碳源進行微生物的培養，從而分離出利用PET單體模擬物的菌株[8-9]，但是，PET單體模擬物畢竟屬于小分子物質，與高聚物有本質區別。

通過進化工程的方法[10]，選育出以PET為唯一碳源的高效降解菌。為研究高聚物底物形態結構對生物反應性的影響，以不同粒徑的PET超細粉末為底物碳源培養微生物。通過檢測菌株生物量的變化、發酵液中產物種類與濃度變化，分析底物粒徑對菌株生長及其對產物形成與細胞利用過程的影響。

1 實驗部分

1.1 菌 株

睪丸酮叢毛單胞菌，天津工業大學紡織學院生態染整課題組培育。

1.2 試劑與藥品

PET切片(西格瑪奧德里奇中國公司)；對苯二甲酸(TA,天津市光復精細化工研究所)；苯甲酸(BA，天津市化學試劑三廠)；雙(2-羥基乙基)對苯二甲酸酯(BHET)、 原兒茶酸(PA，天津市希恩斯生化科技有限公司)；黏康酸(MA，阿法埃莎化學有限公司)；磷酸、甲醇(天津科密歐化學試劑有限公司)。

1.3 儀器與設備

HZQ-Q型全溫振蕩器(哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司)；WND-100型高速中藥粉碎機(浙江省蘭溪市偉能達電器有限公司)；LC-15C型反向高效液相色譜儀(HPLC，日本島津有限公司)；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫療器械廠)； V-1200型可見光分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；DL-101-2ES型電熱鼓風干燥箱(天津市中環實驗電爐有限公司)；D8 DISCOVER GADDS型X射線衍射儀(XRD，德國Bruker AXS公司)；TM-1000型掃描電鏡(日本日立公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 不同粒徑PET超細粉體顆粒的制備

取一定量PET切片，150 ℃烘36 h，充分干燥。取出后轉入高速中藥粉碎機進行粉碎加工，分別用360目和500目標準篩網反復過篩，制得粒徑大于40 μm、25～40 μm和小于25 μm的3種PET超細粉體顆粒。

1.4.2 PET分解菌培養降解

培養基的配制參照文獻[11]方法：準確稱取NH4Cl 1 g、KH2PO43 g、Na2HPO47 g、NaCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、H3BO30.5 μg、FeCl3·6H2O 0.2 μg、MnSO4·5H2O 0.4 μg、ZnCl20.4 μg、CuSO4·5H2O 40 μg、(NH4)6Mo7O24·7H2O 0.2 μg及水1 000 mL，充分溶解后量取100 mL加入到500 mL錐形瓶中， 120 ℃滅菌20 min。

菌株的培養：稱取0.1 g PET粉末添加到滅菌后培養基中，轉接20 mL出發菌株培養液， 37 ℃，140 r/min振蕩培養，定期取樣測試。

1.5 測試方法

1.5.1 粉末的形態結構觀察

對經過粉碎過篩的粉末，采用日立TM-1000掃描電鏡(SEM)對其形態結構和尺寸進行觀察。觀察前要先進行粉末的干燥處理。

1.5.2 生物量的檢測

通過可見分光光度計測量微生物發酵液的光密度(OD值，optical density)來表示菌液的濃度，即每隔一定時間將菌株搖瓶取出，靜置4～6 min，取錐形瓶中部發酵液3 mL置比色皿中，觀察可見分光光度計波長為600 nm的吸光度。

1.5.3 發酵液中產物的檢測

培養過程中每隔一定時間取樣2 mL留做高效液相色譜測試。色譜條件：色譜柱InertSustain C18反相柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為40 ℃；流速為1 mL/min；進樣體積為1 μL；檢測波長為240 nm；流動相為pH值為2.02的60%的CH3OH和0.05 mol/L KH2PO4緩沖溶液。

1.5.4 X射線衍射分析

采用德國Bruker AXS公司的D8 DISCOVER GADDS型X射線衍射儀對經菌株處理前后不同粒徑PET粉末的結晶行為進行分析。2θ范圍設為4°～40°。

2 結果與討論

2.1 底物粒徑結構對產物組成的影響

菌株生長情況能夠表示微生物對底物的利用率，但這對高聚物底物的生物催化分解情況只是間接的反映。為獲得微生物培養條件下，底物形態結構影響PET生物催化分解的直接信息，分別以粒徑大于40 μm和小于25 μm的2種PET超細粉末作為底物，進行PET分解菌的培養，培養一定時間后對發酵液取樣分析，得到不同時刻發酵液樣品的高效液相色(HPLC)譜圖。

通過對比零時刻發酵液的色譜圖與標準物質譜圖(如圖1所示)可知，在實驗色譜條件下，發酵液中的主要產物為保留時間rt為3.16 min時的PA、rt為 3.28 min時的MA、rt為 6.33 min時的BA，rt為 4.01 min處出峰，可推測是以對苯二甲酸為主的物質(TA-m)(TA、3-羥基苯甲酸、BHET)。據文獻[12]報道，酶水解PET纖維產生一定量的TA、BA、BHET等物質，但是在酶處理PET膜或纖維樣品的研究中，尚未見對PA和MA的報道。

圖1 標準物質與零時刻發酵液樣品液相譜圖對比Fig.1 Comparison of HPLC chromatogram between fermentation liquid and standard substance

將2種粒徑底物在各時刻的發酵液樣品HPLC譜圖進行對比，如圖2所示，可發現，培養相同時間的2種發酵液中，產物的種類不盡相同。

通過HPLC譜圖對比可知，在以不同粒徑底物培養菌株條件下，存在一些相同的產物，如PA、MA、BA、TA-m，而且這些物質所形成的峰面積比較大，即這些物質在發酵液中的濃度相對較大，是PET降解的主要產物。隨培養時間的延長，不同粒徑PET的分解產物濃度變化幅度明顯不同，說明微生物對PET顆粒的利用程度不同，小粒徑顆粒更易被分解利用。

圖2 不同粒徑PET底物培養菌株發酵液的譜圖對比Fig.2 HPLC chromatogram of fermentation liquid with different particle size PET substrate

從HPLC譜圖中也可清楚地看出，2種條件下除幾種主要產物外還存在出峰位置不一致的產物，這說明盡管底物化學結構完全相同，但是在整個培養過程中，粒徑不同的底物所形成產物的種類也不是完全相同的，如圖2(a)、(d)中rt=5.28 min出峰處，在同一時刻，該物質在微生物利用小粒徑顆粒時能夠被代謝產生，但對于大粒徑底物則不能被分解產生。

2.2 底物粒徑結構對菌株生長的影響

底物的分解和攝入為菌株的生長代謝提供碳源，生長情況也反映出菌株對底物的利用效率。分別準備了粒徑大于40 μm、小于25 μm和尺寸介于25～40 μm之間的PET超細粉末，作為底物進行PET分解菌的培養。不同粒徑結構底物對菌株生長的影響情況如圖3所示。由圖可見，粒徑小的PET粉末作為底物時，無論是對數期的生長速率，還是穩定期的最大生物量，都遠大于粒徑較大的底物。這說明對于PET這樣的高聚物底物而言，粒徑尺寸等形態結構因素對菌株的生長有顯著影響。

圖3 不同粒徑PET粉末對菌株生物量的影響Fig.3 Effects of PET substrate with different particle size on growth of strains

葡萄糖等可溶性小分子類常規底物能夠被微生物直接攝入細胞內而進入代謝系統，但像PET這樣的不溶性高聚物底物，不能直接被細胞利用。有研究[9]認為，在以聚酯類物質作為底物的生物過程中，首先需要細胞分泌出一定的胞外酶。在酶的催化作用下，聚合物的大分子鏈發生化學鍵的斷裂和分解。隨生物催化分解反應的進行，會陸續產生短鏈物質。當分子鏈足夠短的時候，這些分解產物就可溶解在發酵液中，成為可溶性物質。這些可溶性小分子產物可被細胞攝入，參與細胞內代謝過程。

作為底物的高聚物大分子在胞外酶作用下分解，是整個過程的限速步驟。因胞外酶不能進入高聚物內部，高聚物底物的生物催化分解反應只能在其表面進行，因此，高聚物底物的比表面積對于相應生物過程有重要影響。就本文研究而言，作為底物的PET粉末粒徑越小，其比表面積越大，越易被酶催化分解，產生的小分子物質越多，從而能給菌株提供更多的碳源，有利于菌株的生長。

PET切片經充分粉碎，反復過篩即得大于40 μm、25～40 μm和小于25 μm的顆粒。不同粒徑顆粒是粉碎過程自然形成，即在同一研磨工藝下獲得不同粒徑顆粒，雖然存在剪切應力和熱作用，但是對于粉碎后獲得的微米級顆粒其結晶程度和相對分子質量基本保持一致，這樣保證了整個研究在相同平臺進行。大于40 μm和小于25 μm的粉末顆粒用電鏡對形態結構觀察的結果如圖4所示。

圖4 研磨過篩后的不同粒徑PET粉末電鏡照片(×200)Fig.4 Screening of different particle size PET powder after grinding PET powder(×200). (a) Less than 25 μm;(b) Larger than 40 μm

聚酯切片成分中含有30%玻璃增強顆粒，圖中白色棒狀物質即為玻璃顆粒。由于玻璃成分的主要元素是氧和硅，且穩定性很好，所以不影響實驗材料作為碳源的應用。通過電鏡圖片可清晰地觀察到，經過研磨過篩后的顆粒粒徑顯著不同。圖4(a)為平均粒徑小于25 μm的粉末，圖4(b)為平均粒徑大于45 μm的粉末，并且粉末形狀基本為橢圓球狀。

2.3 底物粒徑結構對產物濃度的影響

盡管不同粒徑結構底物發酵液中產物組成不盡相同，但幾種主要產物在這2種發酵液中都被檢測到。為進一步研究底物粒徑對產物形成的影響，分別對不同粒徑底物發酵液中主要產物濃度變化進行了比較，如圖5所示。

圖5 不同粒徑PET底物的發酵液中主要產物含量變化對比Fig.5 Comparison of concentration changes of main product in fermentation liquid with different particle size of PET substrate

比較不同粒徑底物發酵液中主要產物濃度變化可發現：PET粒徑小于25 μm的發酵液中，幾種主要產物濃度波動比較大；而對于PET粒徑大于40 μm的發酵液，在整個培養過程中幾種主要產物濃度基本呈下降趨勢。說明以不同粒徑PET作為底物碳源培養菌株過程中，微生物對粒徑小于25 μm的PET的利用程度遠大于40 μm的情況。

隨著PET在胞外酶作用下，小分子物質不斷產生，繼而又會被細胞分解而利用。在整個生物催化過程中，細胞生長和代謝情況是變化的，細胞所分泌酶的數量和活性也是不均勻的，導致各種產物的分解速率差異；菌株各生長階段細胞的數量和代謝情況也不一樣，導致菌株對發酵液中產物的利用速率差異。正是產物的形成、分解和細胞攝入等3種因素的共同作用，使得發酵液中產物濃度呈波動狀態，因此，在PET粒徑大于40 μm的發酵液中，幾種主要產物濃度一直減少，是因為顆粒比表面積較大，PET的生物催化效率較低，產物形成的量較少，甚至抵不上因細胞利用而消耗的量。

當以小粒徑PET發酵培養至24 h時，菌株處于對數生長期末期，此時底物降解最為活躍，產物種類和濃度最為豐富，所以PA、MA、TA-m的濃度明顯提高，但BA是4種中間產物中最易被分解利用的小分子物質，所以在PET生物催化的對數末期，BA在較短時間就會被分解掉。當以大粒徑PET為底物時，菌株生長不存在明顯對數生長，對PET降解能力顯著降低，只能依靠發酵液已有中間產物作為碳源維持生長，所以幾種產物濃度基本呈現下降趨勢。而BA在培養至24 h時濃度有所提高，可能是由于一些PET降解產物繼續被菌株分解出BA,而此時菌株數量不足以快速代謝BA，便造成了BA的濃度上升。

2.4 菌株處理對PET底物結晶性能的影響

根據文獻[13-15]，經過酶處理的PET結晶度顯著提高，說明大分子的非晶區更易受到酶分子的作用而發生降解作用。實驗中采用菌株發酵液對不同粒徑的PET顆粒進行3周的降解處理，定期補加新鮮菌液，最后收集底物粉末進行X射線衍射測試。對于粒徑小于25 μm的顆粒，經過3周菌株處理，粉末的結晶度由9.35%提高到14.38%。而粒徑大于40 μm的顆粒,結晶度由9.08%提高到10.39%。由此可知：不同粒徑粉末對菌株的生物反應性不同，小粒徑粉末比表面積大更易被利用；而菌株對PET粉末的作用主要集中在分子鏈運動相對活躍的無定形區域發生有效分解，從而導致PET顆粒結晶度增加。

3 結 論

聚酯的粒徑結構對菌株的生長有顯著影響，粒徑小的粉末作為底物時，無論是對數期的生長速率，還是穩定期的最大生物量，都遠大于粒徑較大的底物；不同粒徑聚酯發酵液中主要產物的種類不盡相同，都含有黏康酸、苯甲酸等，但濃度的變化規律不同，粒徑小的聚酯粉末作為底物時，產物濃度變化波動比較大；而粒徑大的條件下產物濃度波動基本呈下降趨勢，且處于較低的水平。經過菌株的長期處理，小粒徑的聚酯顆粒結晶度明顯提高。鑒于當前聚酯材料的加工多為化學過程，對生物催化劑進行耐酸、耐堿和耐熱等工業適應性改造，以實現工業環境下的聚酯高效生物催化，將是PET生物加工技術將來重要的發展方向。

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Microbial degradation of polyester substrates with different particle sizes

WANG Hongyang1,2, GONG Jixian1,2, LI Huiqin1,2, LI Zheng1,2, LI Qiujin1,2, ZHANG Jianfei1,2

(1.SchoolofTextiles，TianjinPolytechnicUniversity,Tianjin300387,China; 2.KeyLaboratoryofAdvancedTextileCompositesofMinistryofEducation,TianjinPolytechnicUniversity,Tianjin300387,China)

The effect of different particle sizes of polyethylene terephthalate (PET) as substrates on the growth of strain was measured by monitoring concentration changes of strains, products and variety of crystallinity. Another purpose is to explore the role of the substrate size structure in product formation and used by cells. The results showed that when the smaller PET powder as a substrate, the growth rate and biomass of strains were much greater than those when the substrate has a larger size. During the culture process, the composition of products detected in the fermentation liquid varied with the substrate size. And the smaller particles are more easily degraded, which occurred mainly in the amorphous region.

biocatalysis; polyethylenc terephthalate; size; bioreactive

10.13475/j.fzxb.20150400506

2015-04-06

2015-09-20

生態紡織(江南大學)教育部重點實驗室開放基金項目(KLET1101)

王宏陽(1990—)，男，碩士生。研究方向為聚酯材料的生物改性。鞏繼賢，通信作者，E-mail：gongjixian@126.com。

O 63；Q 819

A