談食品中黃曲霉毒素B1的檢測(cè)

山瑛(伊犁州產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所,新疆伊寧 835000)

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談食品中黃曲霉毒素B1的檢測(cè)

山瑛
(伊犁州產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所,新疆伊寧 835000)

【摘 要】食品中黃曲霉毒素的測(cè)定方法是使用GB/T18979-2003《食品中黃曲霉毒素的測(cè)定 免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法》中免疫親和層析法高效液相色譜法進(jìn)行的測(cè)定,但是在實(shí)際測(cè)定中發(fā)現(xiàn)許多細(xì)節(jié)問(wèn)題在測(cè)定中容易忽視,而會(huì)影響測(cè)定的結(jié)果,本文針對(duì)筆者長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題分別對(duì)樣品的處理、標(biāo)準(zhǔn)溶液及衍生液的處理、免疫親和柱等方面做了歸納分析。

【關(guān)鍵詞】黃曲霉毒素B1的測(cè)定 注意事項(xiàng) 免疫親和層析法高效液相色譜法

黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1簡(jiǎn)寫為AFB1)是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?，含有一個(gè)雙呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)?香豆素)。黃曲霉毒素B1是已知的化學(xué)物質(zhì)中致癌性最強(qiáng)的一種。黃曲霉毒素B1對(duì)包括人和若干動(dòng)物具有強(qiáng)烈的毒性，其毒性作用主要是對(duì)肝臟的損害。

B1是最危險(xiǎn)的致癌物，經(jīng)常在玉米，花生，棉花種子，一些干果中常能檢測(cè)到。它們?cè)谧贤饩€照射下能產(chǎn)生熒光，根據(jù)熒光顏色不同，將其分為B族和G族兩大類及其衍生物。AFT目前已發(fā)現(xiàn)20余種。AFT主要污染糧油食品、動(dòng)植物食品等；如花生、玉米，大米、小麥、豆類、堅(jiān)果類、肉類、乳及乳制品、水產(chǎn)品等均有黃曲霉毒素污染。其中以花生和玉米污染最嚴(yán)重。家庭自制發(fā)酵食品也能檢出黃曲霉毒素，尤其是高溫高濕地區(qū)的糧油及制品種檢出率更高。黃曲霉毒素耐熱，280℃才可裂解，故一般烹調(diào)加工溫度下難以破壞。

本文對(duì)GB/T18979-2003《食品中黃曲霉毒素的測(cè)定 免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法》中免疫親和層析法高效液相色譜法測(cè)定食品中黃曲霉毒素B1進(jìn)行探討：

原理：

試樣經(jīng)甲醇-水提取，提取液經(jīng)過(guò)濾、稀釋后，濾液經(jīng)過(guò)含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和柱凈化，此抗體對(duì)黃曲霉毒素B1具有專一性，黃曲霉毒素交聯(lián)在層析介質(zhì)中的抗體上。用水或吐溫-20/ PBS將免疫親和柱上雜質(zhì)除去，以甲醇通過(guò)免疫親和層析柱洗脫，洗脫液通過(guò)帶熒光檢測(cè)器的高效液相色譜儀柱后碘液衍生測(cè)定黃曲霉毒素B1的含量。

筆者就以測(cè)定黃曲霉毒素B1出現(xiàn)的問(wèn)題及注意事項(xiàng)談幾點(diǎn)：

1 樣品處理

(1)固體樣品需進(jìn)行樣品的粉碎，通過(guò)2mm分樣篩并均勻樣品。

(2)樣品加入甲醇水溶液提取后過(guò)濾后，應(yīng)嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣品進(jìn)行加水稀釋處理，如果樣品未稀釋會(huì)造成過(guò)免疫親和柱時(shí)黃曲霉毒素B1的含量過(guò)柱損失。

(3)樣品加入甲醇水溶液提取后需高速均質(zhì)1min，或在200r/ min-300r/min劇烈震蕩20min、或超聲提取15min，使樣品被提取被測(cè)物充分提取。

(4)樣品應(yīng)用玻璃纖維濾紙過(guò)濾除去蛋白質(zhì)沉淀物、粘稠性液體過(guò)濾達(dá)到樣品液體凈化。

(5)樣品處理好后應(yīng)及時(shí)檢測(cè)，若不能及時(shí)檢測(cè)則應(yīng)將樣品防止與冰箱中冷藏儲(chǔ)存，但時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。

(6)黃曲霉毒素B1可致癌，應(yīng)戴手套進(jìn)行標(biāo)液的配置和樣品的操作，使用過(guò)的容器應(yīng)置于專用貯存容器(裝有5%次氯酸鈉溶液)內(nèi)，浸泡24小時(shí)以上進(jìn)行處理。

2 標(biāo)準(zhǔn)溶液及衍生液的處理

(1)黃曲霉毒素B1標(biāo)液應(yīng)嚴(yán)格按要求進(jìn)行放置保存，配置的標(biāo)準(zhǔn)工作液應(yīng)放置在-18℃避光保存效果較好。

(2)柱后衍生溶液0.05%碘溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配置，配置溶液盡可能速度快，配置后應(yīng)盛放在棕色的衍生玻璃瓶中，使用前需使用0.45 μm濾膜過(guò)濾并超聲處理，防止不溶物堵塞管路、過(guò)濾器及限流器，使用柱后衍生系統(tǒng)時(shí)應(yīng)先根據(jù)碘液的量在0.3-0.5Mpa下使衍生液的量通入足夠的氮?dú)狻?/p>

圖1 黃曲霉毒素B1標(biāo)液0.001 μg/ml

圖2 黃曲霉毒素B1陰性樣品

圖3 陽(yáng)性樣品

圖4 陰性加標(biāo)樣品

(3)在開啟試劑泵之前，確保液相色譜泵的正常工作，液體充滿系統(tǒng)，柱壓425Psi或30bar的壓力后設(shè)置流速開啟泵，等待壓力平穩(wěn)。

3 免疫親和柱

(1)過(guò)濾的樣品通過(guò)免疫親和柱吸附樣品液中的黃曲霉毒素B1，從而對(duì)黃曲霉毒素B1起到針對(duì)性的純化作用，過(guò)柱凈化后的樣品液可直接用于HPLC進(jìn)行檢測(cè)，達(dá)到快速測(cè)定的目的，以改善信噪比，提高檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度。測(cè)定時(shí)選擇合適的免疫親和柱并了解柱子性能，嚴(yán)格按親和柱說(shuō)明書使用和存儲(chǔ)，對(duì)過(guò)濾柱子的樣品稀釋液的PH范圍進(jìn)行控制，(北京華安麥科生物科技有限公司的黃曲霉毒素B1的親和柱要求樣品的PH在6-8之間，若偏離此范圍需要用適量的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)整PH值)。樣品過(guò)小柱控制在1-2滴/秒的速度流出，待液體排干后，用水淋洗柱子時(shí)可控制流速為2-3滴/秒；用1ml甲醇洗脫柱子時(shí)控制流速為1滴/1.5秒。

(2)柱子保存溫度在4℃冰箱，不應(yīng)冷凍，使用至少提前半小時(shí)取出放于室溫下，使柱子盡量恢復(fù)到室溫(22-25℃)。

(3)上柱子的樣品溶液，一定要嚴(yán)格控制甲醇的含量不能過(guò)高（低一些倒無(wú)妨），至少應(yīng)嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋后上樣。如果樣品處理要求水相，應(yīng)盡量用水相。

（4）上樣前，讓柱子里面的保護(hù)液完全流干凈，上樣后，應(yīng)嚴(yán)格控制流速樣品過(guò)小柱控制在1滴/秒的速度流出。上樣時(shí)盡量不要加壓，加壓可能會(huì)流速過(guò)快，降低吸附的毒素量，盡可能使樣品過(guò)柱的流速放緩，讓樣品中的毒素有足夠的時(shí)間和親和柱里面的抗體充分接觸并結(jié)合在一起。

（5）清洗步驟待液體排干后，用水淋洗柱子時(shí)可控制流速為2-3滴/秒；過(guò)濾速度不應(yīng)太慢，否則會(huì)洗掉一些已經(jīng)吸附的毒素。若樣品比較干凈用5ml水淋洗柱子即可，復(fù)雜些的樣品可以是10ml或更多來(lái)清洗小柱。

（6）洗脫時(shí)，用純甲醇，充分溫育至少2分鐘，洗脫時(shí)不可加壓，速度也不應(yīng)過(guò)快，控制洗脫柱子時(shí)控制流速至少為1滴/1.5-2秒。

4 儀器設(shè)備條件

高效液相色譜儀的流動(dòng)相的比例調(diào)整為甲醇-水(55+45)，柱后衍生化系統(tǒng)衍生溶液流速調(diào)整為0.3ml/min，反應(yīng)管溫度70℃。黃曲霉毒素B1的峰形效果較理想。筆者測(cè)定一組黃曲霉度素B1標(biāo)液標(biāo)液溶度為0.001μg/ml、0.005μg/ml、0.01μg/ml、0.015μg/ml時(shí)相關(guān)系數(shù)r=0.99974，測(cè)定一陰性樣品的加標(biāo)回收率在115-120%之間，陽(yáng)性樣品為2013年國(guó)家認(rèn)監(jiān)委組織的食用植物油中黃曲霉毒素B1能力驗(yàn)證項(xiàng)目，通過(guò)此方法條件測(cè)定結(jié)果為滿意。(安捷倫1260液相色譜儀、Agilent TC-C18色譜柱、0.600ml/min、進(jìn)樣量20μ l；柱后衍生設(shè)備：美國(guó)Pickering Vector PCX 柱后衍生儀)色譜圖如圖1到圖4：

圖1、黃曲霉毒素B1標(biāo)液0.001μg/ml，在調(diào)整后了標(biāo)準(zhǔn)中條件后出的色譜峰峰形、及重現(xiàn)性好；

圖2、陰性樣品在目標(biāo)峰前后沒有任何雜峰；

圖3、陽(yáng)性樣品，目標(biāo)峰出峰峰形較好、峰的分離度較高、周圍無(wú)雜峰，及重現(xiàn)性好；

圖4、陰性加標(biāo)樣品目標(biāo)峰出峰峰形較好、峰的分離度較高、周圍無(wú)雜峰，及重現(xiàn)性好。

5 柱后衍生的維護(hù)

(1)柱后衍生測(cè)定樣品后，在清洗時(shí)應(yīng)用純甲醇進(jìn)行徹底清洗，至少用30分鐘沖洗泵腔及其管路。

(2)柱后衍生系統(tǒng)應(yīng)嚴(yán)格按開關(guān)機(jī)順序進(jìn)行操作，避免操作不當(dāng)衍生液倒進(jìn)入色譜柱中，破壞色譜柱。

(3)長(zhǎng)期關(guān)機(jī)時(shí)，應(yīng)將試劑瓶中剩余衍生試劑清空，換成20%的甲醇水溶液沖洗泵腔機(jī)管路，黃曲霉毒素測(cè)定時(shí)用100%甲醇沖洗泵腔機(jī)其管路。

參考文獻(xiàn):

[1]GB/T18979-2003《食品中黃曲霉毒素的測(cè)定免疫親和層析化高相液相色譜法和熒光光度法》.

[2]北京華安麥科生物技術(shù)有限公司黃曲霉毒素B1免疫親和柱說(shuō)明書.

作者簡(jiǎn)介:山瑛 (1976—),女,俄羅斯族,工程師,質(zhì)檢員從事檢驗(yàn)工作。