基于天然氨基酸的蛋白質修飾

侯穎欽　呂 華*(北京大學化學與分子工程學院，北京 100871)

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基于天然氨基酸的蛋白質修飾

侯穎欽呂 華*
(北京大學化學與分子工程學院，北京 100871)

摘要：基于天然氨基酸的蛋白質修飾種類繁多，由于在不同的氨基酸上所進行的修飾會對蛋白質的結構和功能產生不同的影響，所以科學家們一直在探索基于天然氨基酸特異的蛋白質修飾策略。本文主要以半胱氨酸、酪氨酸和蛋白質氮端特異修飾為例，簡要回顧目前基于天然氨基酸的蛋白質化學的相關工作。

關鍵詞：蛋白質修飾；天然氨基酸；半胱氨酸；酪氨酸

1 背景介紹

對蛋白質進行化學修飾可以帶來新的性質和功能，從而調控蛋白的生物活性。而事實上，蛋白質在生物體內的翻譯后修飾是十分常見的現象，能極大地增加蛋白質的結構和功能的多樣性。比如蛋白特定氨基酸的乙酰化、甲酰化、磷酸化、磺酸化、泛素化和糖基化等，可以影響細胞的信號傳導、分化、遷移等活動[1]。因此，發展正交的化學反應對蛋白質中的天然氨基酸進行特異性修飾，具有重要的研究意義[2]。 由于蛋白質含有多種不同的氨基酸側鏈官能團，為了保證修飾的特異性，這些反應必須具有較好的官能團選擇性。此外，由于蛋白質多級結構的不穩定，對它們的修飾必須同時保證蛋白質的結構和功能不受破壞和影響。因此，在接近生理環境條件(≤37 ℃， pH 6–8，μmol·L–1濃度)下即可以進行的高效率、高特異性和高轉化率的化學反應成為了此類反應的首選[3,4]。

本文主要以半胱氨酸、酪氨酸和蛋白質氮端氨基酸為例，總結近年來天然氨基酸特異性的蛋白質修飾，并對該研究領域的發展方向做出展望。

2 天然氨基酸特異性的蛋白質修飾

在蛋白質的氨基酸序列中，雖然半胱氨酸在數量上所占比例并不高，但是由于其具有顯著的親核性和氧化還原性，易于修飾，被廣泛應用于蛋白的選擇性修飾。

基于半胱氨酸的蛋白質修飾較為常用的方法包括二硫鍵的交換反應(圖1a)[5]、烷基化(圖1b)[5]以及與馬來酰亞胺(圖1c)[6]或乙烯基砜(圖1d)[7,8]的麥克爾加成反應。Brik等利用二硫鍵的交換反應對α-球蛋白中的半胱氨酸進行修飾，在較為溫和的條件(pH 7.0)下，1 h即可達到42%的產率，但是由于該反應可逆，所以轉化產率難以提高，并且新生成的二硫鍵在還原性環境中較易被破壞，從而降低蛋白質修飾產物的穩定性。因此，Brik等又利用α-鹵代羰基化合物(如碘乙酰胺等)與α-球蛋白中唯一的半胱氨酸反應，對其進行修飾以提高蛋白質修飾產物的穩定性。此外，馬來酰亞胺和乙烯基砜與巰基的麥克爾加成反應是非常經典的修飾巰基的反應。目前，很多市售的巰基反應活性的熒光染料為馬來酰亞胺修飾。所以，這也是對蛋白質中半胱氨酸修飾選擇性較好的修飾方法。

圖1　基于半胱氨酸的蛋白質修飾的經典反應

其他基于半胱氨酸的蛋白質修飾如圖2、圖3所示。根據所利用的化學反應機理不同分為極性反應和光催化反應。

Baker小組和Caddick小組研究了半胱氨酸與溴代馬來酰亞胺的極性反應，分別通過半胱氨酸的可逆烷基化(圖2a, 2b)和不可逆烷基化(圖2c)對蛋白質進行修飾，不僅可以用于體外的蛋白質反應[9,10]，還可以在活細胞中對蛋白質進行修飾[11]。而后，Caddick小組[12]通過兩步反應利用2, 5-二溴代己二酰胺與半胱氨酸在較為溫和的條件下(21–37 ℃)反應得到了較高的轉化率(>95%)。半胱氨酸也可以與缺電子的烯丙基酰胺/酯或者烯丙基酮等反應生成乙烯基硫化物(圖2d)，這類反應速度快，生物正交性好。 Che等[13]利用帶有銥配合物的烯丙基酰胺與半胱氨酸的反應對BSA(半胱氨酸個數多達70個，其中約一半左右的半胱氨酸互相形成二硫鍵)和HSA(含有72個半胱氨酸，其中32個互相形成二硫鍵)成功修飾，形成蛋白-一銥配合物雜化體，可以通過磷光實現生物成像。Wagner等[14]則研究了圖2e中APN與半胱氨酸的反應，發現這類反應不僅反應速度快，并且生成的產物穩定性好，且在反應過程中對半胱氨酸具有良好的選擇性。

圖2　基于半胱氨酸的蛋白質修飾的極性反應

圖3　基于半胱氨酸的蛋白質修飾的光催化反應

如圖3所示，在光催化反應中，包括3種反應，其中巰基-烯(thiol-ene)反應最常用到。利用thiolene[15–17]或巰基-炔(thiol-yne)[18]反應與蛋白質的半胱氨酸進行偶聯時需要有自由基引發劑或者光激發反應。Liu等[16]在利用thiol-ene反應對蛋白進行乙酰化標記時通過蛋白質的溶解性研究表明，thiolene反應過程中自由基的產生并沒有導致蛋白質變性，而Strieter等[17]在利用thiol-ene反應研究泛素的不同數目聚體的功能與結構時也發現，thiol-ene反應本身對泛素的結構與功能并沒有太大影響，而是在不同位置和取向的偶聯體對泛素在蛋白質水解過程中的作用會有較大影響。因此，可以推測自由基的產生對蛋白質本身的結構與性質并沒有非常重要的影響。與thiol-ene蛋白質修飾方法相比，thiolyne反應可以進行兩次修飾，因此可以分別引入兩種不同的官能團，從而對蛋白質進行雙官能團化修飾。

基于半胱氨酸的蛋白質修飾方法種類豐富，但是被大家廣泛應用的是半胱氨酸與馬來酰亞胺的反應和thiol-ene反應。由于絕大多數蛋白質序列中均含有半胱氨酸，所以該修飾方法適用范圍廣泛。但是，半胱氨酸在蛋白質中往往會形成二硫鍵，當在半胱氨酸上進行修飾時很可能會對蛋白質的結構或性質有一定的影響。所以科學家們也在積極探索在其他氨基酸上進行修飾。

2.2基于酪氨酸的蛋白質修飾

加州大學Berkeley分校的Francis小組和斯克里普斯研究所的Barbas小組在基于酪氨酸的特異性蛋白質標記方面做出了很多工作(圖4)。Barbas和Francis等小組[19–21]利用帶有吸電子基團的重氮化合物與酪氨酸酚羥基的鄰位反應生成偶氮化合物，反應速度很快(<4 h)，條件溫和(pH 9.0, 4 ℃即可反應)，并且對酪氨酸的選擇性較好(圖4a)。2004年，Francis小組[22]提出了圖4b所示的Mannich類型的酪氨酸修飾方法。這種方法反應效率很高，并且條件溫和，三組分反應使其能夠引入多種官能團。2011年，Francis等[23]又利用硝酸鈰銨作為催化劑實現了對酪氨酸的選擇性修飾，反應速度更快(<1 h)，且需要的底物濃度也比較低(圖4c)。關于酪氨酸的選擇性修飾還有酪氨酸酚羥基鄰位和雙鍵的反應等，反應效率均比較好[24]。

圖4　基于酪氨酸的蛋白質修飾

基于酪氨酸的蛋白質修飾反應選擇性較好，而且主要利用的是側鏈酚環的富電子特性，所以從反應機理上來看基本一致，反應類型比較單一。

2.3基于天然氨基酸的蛋白質N-端特異性修飾

基于蛋白質N-端氨基酸的修飾主要分為兩類，一類以氨基修飾為主(圖5a, 5b)[25–27]，這類反應通常對氨基酸種類的選擇性不大，雖然N-端的氨基和賴氨酸中ε-氨基的pKa不同，通過控制反應體系的pH可以使其對氨基有一定的選擇性，但是仍然不能做到完全選擇性，例如圖5a為Wong和Che等[26]的研究工作，利用烯酮化合物與氨基的反應對蛋白質的N-端進行修飾，基本上只要N-端有游離的氨基即可進行修飾。此外，可以通過串聯反應或者利用反應本身對N-端氨基酸的選擇性來實現N-端氨基的選擇性修飾。如Francis等則利用磷酸吡哆醛將蛋白質N-端氧化成雙羰基酮或醛，再與胺氧反應進行修飾，在pH 7.5的條件下，數小時(4 h)內就可以得到較高的轉化效率[25]，而后其又將磷酸吡哆醛換為具有同樣作用的兩個分子(稱為Rapoport's鹽)，對谷氨酸有一定的選擇性[27]。另一類則有一定的氨基酸選擇性，例如圖5c、5d所示， Neri等[28]利用醛與N-端半胱氨酸的成環反應將帶有醛基的西馬多丁與N-端帶有半胱氨酸的單克隆抗體F8進行偶聯以實現藥物分子的靶向性輸運。Francis等[29]則利用金屬配合物作為催化劑，對N-端的脯氨酸進行修飾，如圖5d所示，反應條件比較溫和，選擇性很好并且反應效率很高。

圖5　基于天然氨基酸的蛋白質N-端修飾

2.4基于其他天然氨基酸的蛋白質修飾

賴氨酸是最傳統的用于蛋白質修飾的氨基酸，然而由于蛋白質上的賴氨酸數目眾多，這種方法通常無法很好地控制修飾的位點和數目，容易對蛋白質結構和功能帶來影響。Barbas等[30]發展了基于催化抗體 (catalytic antibody)的賴氨酸修飾方法，但是并不具備普適性。基于其他天然氨基酸修飾的方法研究較少，目前有關于絲氨酸[31]、色氨酸[32]等的修飾方法，但是較為單一，并且應用較少。

3 總結與展望

基于天然氨基酸的蛋白質修飾在最小程度上避免了對蛋白質本身結構的改變，以期最大程度利用蛋白質本身的結構與性質，并且通過修飾基團對蛋白質的性質進行改善和提高。雖然這種利用蛋白質本身具有的氨基酸進行蛋白質修飾的方法簡單快速，但卻面臨著選擇性的問題。氨基酸選擇性和修飾位點與數量的選擇性一直是這類修飾方法所面臨的挑戰與問題，所以在蛋白質的天然氨基酸修飾方面科學家們將繼續致力于選擇性修飾的研究，并且近年來已經有很多利用非天然氨基酸進行蛋白質修飾的方法產生[4,33,34]，這將為蛋白質修飾帶來更多的選擇策略。

參 考 文 獻

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? 教學研究與改革?

Protein-Modification Based on Canonical Amino Acid

HOU Ying-QinLV Hua*
(College of Chemistry and Molecular Engineering, Peking University, Beijing 100871, P. R. China)

Abstract:Chemical modifications on certain amino acids can result in diverse effects on protein structures and functions. For this, numerous strategies have been developed for site-specific or residue-specific protein modifications. Here we summarize the latest progresses on proteinmodification based on canonical amino acids such as cysteine, tyrosine and N-terminus.

Key Words:Protein-modification; Canonical amino acid; Cysteine; Tyrosine

*通訊作者，Email: chemhualu@pku.edu.cn

doi:10.3866/pku.DXHX20160101www.dxhx.pku.edu.cn

中圖分類號：O6；G64