EPHB6缺失突變del915-917對非小細胞肺癌體內轉移的影響*

西安醫學院第二附屬醫院中心實驗室(西安 710038)

于　軍　鐵　茹　張學策　常　盼　趙　鴿△　陳寶瑩▲

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EPHB6缺失突變del915-917對非小細胞肺癌體內轉移的影響*

西安醫學院第二附屬醫院中心實驗室(西安 710038)

于軍鐵茹張學策常盼趙鴿△陳寶瑩▲

摘要目的：探討EPHB6缺失突變del915-917對非小細胞肺癌(NSCLC)體內轉移的作用。方法：定點突變EPHB6的表達載體pcDNA4-EPHB6-wt獲得突變載體pcDNA4-EPHB6-del915-917，轉染肺腺癌細胞A549，進而將細胞接種于NOD/SCID小鼠體內，通過轉移灶計數、HE染色評價轉移情況。結果：表達EPHB6-del915-917的NSCLC細胞體內轉移顯著強于表達野生型EPHB6-wt的細胞。結論：EPHB6的缺失突變del915-917促發NSCLC體內轉移。

主題詞癌，非小細胞肺腫瘤轉移移碼突變 @EPHB6

非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中主要的病理類型，包括鱗癌、腺癌、大細胞癌。約75%的NSCLC患者發現時已處于中晚期，5年生存率很低。NSCLC轉移造成的術后易復發以及放、化療失敗，是患者存活率、治愈率得不到提高的根本原因[1]。生促紅素人肝細胞(Erythropoiet in-producing hepatoma cell line，EPH)受體家族，與其配體Ephrin之間的信號傳遞介導了許多重要的生理和病理過程：如胚胎形成、神經發育、腫瘤的發生與轉移等[2]。EPHB6是EPH家族的成員之一，以往的研究表明EPHB6與乳腺癌、神經母細胞瘤、前列腺癌等多種腫瘤的轉移呈負相關。最近，我們通過基因測序技術，篩查EPHB6編碼區的序列，發現了EPHB6的一個新的突變位點del915-917，該突變造成EPHB6分子缺失3個氨基酸。生物信息學分析表明，該突變可能會損害EPHB6的功能[3]。本研究擬在前期研究的基礎之上，采用NOD/SCID小鼠，評價EPHB6-del915-917對于NSCLC細胞體內轉移的作用，明確該突變的功能，為臨床NSCLC的診斷和治療提供新的切入點。

材料和方法

1EPHB6突變表達載體的獲得將人EPHB6的cDNA編碼區(base 833-3853 NCBI Accession No. NM_004445)克隆進入pcDNA4 To/myc/hisA表達載體(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。采用QuickChange XL定點突變試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA，USA)對EPHB6的編碼區進行缺失突變。突變反應以pcDNA4-EPHB6作為模板，上游引物為：5’- AGGCTGGCGGGGAAAGGCCTTCCCAGG，下游引物為：5’- CCTGGGAAGGCCTTTCCCCGCCAGCCT。

2細胞培養與轉染A549細胞系采用含10 %胎牛血清的DMEM培養基(美國Invitrogen公司)，于37℃、5 % CO2的孵箱中培養。細胞轉染采用轉染試劑Nanofectin(PAA， Austria)，操作按照說明書進行。pcDNA4(空載體)、野生型EPHB6表達載體(pcDNA4-EPHB6-wt)或突變性EPHB6表達載體與EGFP的表達載體(pcDNA3.1-GFP，表達綠色熒光蛋白EGFP)共轉染。為了得到穩定轉染的細胞，用700 μg/ml的G418(Sigma，St.Louis，MO，USA)和400 μg/ml的Zeocin(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)進行篩選。并且，利用流式細胞儀FACS對EGFP表達陽性的細胞進行分選。對得到的穩定轉染細胞采用Western blotting對于EPHB6的表達水平進行確認。

3Western blot按照我們以往報道的方法進行[4]。蛋白檢測：一抗采用兔抗人 EPHB6 (1μg/ml，Santa Cruz，USA)，內參照actin檢測采用小鼠抗人β-actin(40 ng/ml，Sigma，USA)。采用辣根過氧化物酶(HRP)耦聯二抗， ECL法顯色。

4體內遷移實驗采用8～10周齡的NOD/SCID小鼠(第四軍醫大學實驗動物中心)。在接種腫瘤細胞1 d之前，22只NOD/SCID小鼠，經過3.5 Gy的鈷60照射1次。接種時，分別將3×105穩定轉染的腫瘤細胞懸浮于200 μl PBS，經過尾靜脈注射。接種后4周，處死小鼠，檢測肺部的轉移灶。通過檢測肺部的腫瘤結節來判定轉移的形成。并將小鼠的肺臟用4 %的多聚甲醛固定，HE染色觀察。

5統計學方法利用SPSS 15.0軟件進行數據處理，實驗數據表示為均數±標準差，多組間兩均數比較采用方差分析，兩獨立樣本均數比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1EPHB6-wt組、EPHB6- del915-917在肺腺癌細胞系A549中的表達以pcDNA4為空載體對照，分別構建EPHB6-WT和EPHB6-del915-917表達載體，轉染A549肺腺癌細胞，篩選得到穩定表達的細胞。Western blotting結果顯示，EPHB6-del915-917和EPHB6-WT的表達水平穩定(圖1)。將穩定轉染的細胞用于后續的體內實驗。

圖1野生型(EPHB6-wt)和突變型(EPHB6-mut)

EPHB6在A549細胞中的表達

2EPHB6-del915-917促進A549細胞在NOD/SCID小鼠體內轉移于NOD/SCID小鼠尾靜脈分別注射EPHB6-wt的A549細胞(n=10)、EPHB6-del915-917的A549細胞(n=10)或空載體對照細胞(n=2)。在接種后1周，EPHB6-wt和EPHB6-del915-917組分別有1只小鼠死亡。因此，接種后4周，檢查肺部的轉移病灶時，EPHB6-wt和EPHB6-del915-917組分別只有9只小鼠。如圖2所示，表達EPHB6-wt的細胞在小鼠體內形成的轉移灶數目顯著少于對照組或EPHB6-mutant組(P<0.05)。其中，EPHB6-WT組中，1只小鼠未發生轉移；2只小鼠轉移灶數為1；2只小鼠轉移灶數為3； 3只小鼠轉移灶數分別為4、5、8；僅有1只小鼠有30個轉移灶。而EPHB6-mutant組中，多達4只小鼠分別產生了30個轉移灶。圖2A中橫線為對應散點數據的中位數，從中位數的比較也可看出表達EPHB6-mutant的A549細胞的體內轉移能力顯著強于表達EPHB6-wt的A549細胞。大體解剖(圖2B)和HE染色(圖2C)的結構進一步證實了上述結論。

(A)NOD/SCID小鼠肺部腫瘤病灶數目；(B)NOD/SCID小鼠肺的照片，箭頭指示為腫瘤病灶； (C)NOD/SCID小鼠肺的HE染色(×40)

圖2NOD/SCID小鼠體內A549細胞的轉移

討論

本研究采用的非肥胖糖尿病/嚴重聯合免疫缺陷(non-obese diabetes-SCID mice，NOD/SCID)小鼠作為腫瘤體內轉移研究的模型。NOD/SCID小鼠具有T、B淋巴細胞聯合免疫缺陷，且NK細胞活性低下、無循環補體、巨噬細胞和抗原提呈細胞功能損害等特性。NOD/SCID小鼠在腫瘤研究領域具有廣闊的應用前景。本研究首次報道了EPHB6-del915-917促發NSCLC的體內轉移。這一實驗結果為明確EPHB6在NSCLC中的作用，特別是EPHB6突變的功能提供了直接的實驗證據。

以往，我們報道EPHB6受體型酪氨酸蛋白激酶抑制非小細胞肺癌轉移[4]。本研究發現，EPHB6的缺失突變，不但造成EPHB6分子在結構上缺失3個氨基酸，更重要的是造成EPHB6野生型分子原有的腫瘤轉移抑制效應消失，而且EPHB6-del915-917還促發NSCLC細胞體內轉移。推測，其機制可能為：①EPHB6-del915-917對于野生型EPHB6產生競爭性抑制，從而削弱EPHB6的轉移抑制效應；②與野生型EPHB6不同，EPHB6-del915-917可能激活了促進腫瘤細胞轉移的細胞信號轉導通路。但這還需要實驗驗證。

許多基因的“質”和“量”與腫瘤的發生、發展、轉移和預后關系密切。所謂“量”，就是基因的表達水平，所謂“質”就是該基因表達產物的結構和功能是否正常。我們以往在NSCLC的臨床標本和細胞系中檢測均發現，NSCLC中EPHB6表達水平降低，這與其啟動子區的高甲基化水平有關[5-6]。即NSCLC中EPHB6發生“量”的降低；本研究中，EPHB6的突變造成其氨基酸序列的變化，也就是其結構，即“質”的異常，進而影響到其功能。我們課題組針對EPHB6開展的系列研究，一直是緊扣基因的 “質”和 “量”這兩條主線而展開，并逐步深入的。篩查功能明確的EPHB6的突變有可能成為臨床NSCLC早期診斷、判斷預后，以及治療方案制定的重要指標。但其臨床應用價值，從很大程度上取決于該突變的發生頻率，突變頻率越高，其臨床應用價值越大。因此，在本研究動物實驗的基礎之上，課題組將進一步篩查該突變在NSCLC患者標本中的發生頻率，并與NSCLC的轉移做相關性分析。

參考文獻

[1]Serke M，Sch?nfeld N.Diagnosis and staging of lung cancer[J].Dtsch Med Wochenschr，2007，132(21)：1165-1169.

[2]Eph Nomenclature Committee (1997) Unified nomenclature for Eph family receptors and their ligands. The ephrins[J].Cell，1997，90：403-404.

[3]于軍，鐵茹，趙鴿，等.非小細胞肺癌中EPHB6基因突變的篩選和功能預測[J].山西醫科大學學報，2014，45(7)：557-560.

[4]鐵茹，胡浩，谷仲平，等.EPHB6受體型酪氨酸蛋白激酶抑制非小細胞肺癌轉移[J].陜西醫學雜志，2011，40(6)：650-652.

[5]鐵茹，胡浩，谷仲平，等.EPHB6受體型酪氨酸蛋白激酶在非小細胞肺癌中高甲基化失活[J].山西醫科大學學報，2011，42(3)：194-198.

[6]Müller-Tidow C，Diederichs S，Bulk E，etal.Identification of metastasis-associated receptor tyrosine kinases in non-small cell lung cancer[J].Cancer Res，2010，65：1778-1782.

(收稿：2015-09-17)

Del915-917，the deletion mutation of the EPHB6， promotes in vivo metastasis of non-small cell lung cancer in NOD/SCID mice

Experimental Center， Second Affiliated Hospital， Xi’an Medical University(Xi’an 710038)

Yu JunTie RuZhang Xueceet al

ABSTRACTObjective：To clarify the effects of del915-917， a deletion mutation of EPHB6， on the in vivo metastasis of NSCLC (non-small cell lung cancer) in NOD/SCID mice.Methods：Site-directed mutagenesis was performed from pcDNA4-EPHB6-wt to pcDNA4-EPHB6-del915-917， which was transfected into A549 lung adenocarcinoma cells. The cells were then injected into NOD/SCID mice. The metastatic status were evaluated by metastasis counting and HE staining.Results：Cells expressing EPHB6-del915-917 demonstrated significant higher levels of metastasis， compared with cells expressing EPHB6-WT. Conclusion：The deletion mutation del915-917 increased the metastatic capability of NSCLC cells in NOD/SCID mice.

KEY WORDSCarcinoma，non-small-cell lungNeoplasm metastasis Frameshift mutation@EPHB6

通訊作者：▲第四軍醫大學唐都醫院放射科

【中圖分類號】R734.1

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.02.002

*國家自然科學基金資助項目(30801385)

衛生部腫瘤個體化治療分子診斷專項課題(W2013FZ20)

陜西省社會發展攻關課題(2014K11-01-01-07)

陜西省教育廳基礎研究專項課題(14JK1616)

△西安交通大學第一附屬醫院麻醉科