β-欖香烯對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖作用的影響*

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬西安市中心醫(yī)院(西安 710003)

李建英△　魚　軍　苗　宇　王娟紅　杜旭升　王　波　張惠民　劉　安　王一理△▲

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β-欖香烯對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖作用的影響*

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬西安市中心醫(yī)院(西安 710003)

李建英△魚軍苗宇王娟紅杜旭升王波張惠民劉安王一理△▲

摘要目的：探討β-欖香烯對(duì)肺腺癌細(xì)胞的抗腫瘤作用及其機(jī)制。方法：使用RT-PCR和Western blot法檢測(cè)β-欖香烯對(duì)腫瘤細(xì)胞中P53 mRNA和蛋白表達(dá)的影響；同時(shí)使用差速離心法提取外泌體，利用電鏡和Western blot 法進(jìn)行分析。通過(guò)轉(zhuǎn)染P53 siRNA構(gòu)建P53下調(diào)細(xì)胞株。對(duì)BABL/c裸鼠腫瘤模型皮下注射A549細(xì)胞，探索體內(nèi)環(huán)境下β-欖香烯對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。結(jié)果：①通過(guò)siRNA技術(shù)構(gòu)建P53下調(diào)細(xì)胞株，觀察到β-欖香烯對(duì)A549細(xì)胞的作用依賴于P53的表達(dá)；②A549細(xì)胞源性的外泌體能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖；③體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)β-欖香烯通過(guò)上調(diào)P53表達(dá)和外泌體的釋放實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。結(jié)論：β-欖香烯通過(guò)調(diào)控P53的表達(dá)和外泌體的釋放來(lái)影響肺癌細(xì)胞的增殖。

主題詞肺腫瘤 欖香烯 細(xì)胞增殖外泌體

欖香烯(1-甲基-1-乙烯基-2，4-二異丙烯基環(huán)己烷)是一種從中草藥姜黃中分離出來(lái)的具有抗腫瘤作用的藥物，分為α-、β-以及γ-欖香烯3種。β-欖香烯作為主要的抗腫瘤成分，在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中已被證明具有抗腫瘤作用并且其副作用少[1]，因此具有更好的前景。初步研究提示β-欖香烯通過(guò)引起G2-M期阻滯以及下調(diào)Bcl-2 和Bcl-xl實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的[2-3]。但目前β-欖香烯的抗腫瘤機(jī)制尚不清楚，β-欖香烯的抗腫瘤作用是否還存在其他調(diào)控途徑也不清楚。本研究中我們發(fā)現(xiàn)β-欖香烯能夠上調(diào)P53的表達(dá)，同時(shí)增加外泌體的釋放，從而闡明了P53在β-欖香烯抗肺癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)凋亡中的具體作用。

材料與方法

1材料人肺腺癌細(xì)胞A549和H460 購(gòu)自ATCC；10%胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、脂質(zhì)體2000購(gòu)自GIBCO公司；RIPA裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；BALB/c雄性裸鼠購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2細(xì)胞培養(yǎng)人肺腺癌細(xì)胞A549和H460 (ATCC，Rockville，MD)在含有10%胎牛血清(Gibco BRL， Gaithersburg， MD)、100 IU/ml青霉素以及100 g/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco BRL， Gaithersburg， MD)中培養(yǎng)。細(xì)胞在37℃、含有5% CO2和 95% 空氣的培養(yǎng)箱中孵育。

3RT-PCR使用試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)在A549細(xì)胞中提取總RNA，之后將2 μg的總RNA加入反轉(zhuǎn)錄體系中，參照說(shuō)明完成實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)。引物序列：P53[4]：5’-ATTCTGGGACAGCCAAGCT-3’、5’-TAGTTGTAGTG-GATGGTGGTA-3’；GAPDH：5’-CAAGCTCATTTCCTGGTATGAC-3’、5’-CAGTGAGGGTCTCTCTCTTCCT-3’。GAPDH作為實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參。相關(guān)基因的表達(dá)水平使用GAPDH mRNA和2-△△CT法進(jìn)行計(jì)算。

4Western blot免疫印跡法用于檢測(cè)肺癌A549細(xì)胞P53和外泌體的表達(dá)水平。用RIPA裂解液(Beyotime， Nantong，China)在A549細(xì)胞中提取總蛋白及外泌體。將等量的蛋白質(zhì)加入到12%的SDS-PAGE，之后用電泳的方法對(duì)蛋白進(jìn)行分離。一抗為兔單克隆和多克隆抗體，HRP連接的羊抗兔抗體作為二抗。通過(guò)ELC顯色法將結(jié)合的抗體進(jìn)行顯色。β-actin作為內(nèi)參用于計(jì)算其他蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。

5外泌體分離用系列離心步驟對(duì)外泌體進(jìn)行分離。將培養(yǎng)過(guò)細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行收集，在300×g環(huán)境下離心5 min，1200×g環(huán)境下離心15 min除去細(xì)胞碎片。棄去上層液體后在7000×g環(huán)境下離心50 min，用PBS洗滌后在100000×g環(huán)境下離心60 min。用PBS對(duì)沉淀進(jìn)行重懸，在100 000×g環(huán)境下離心60 min。最后將PBS重懸收集到的外泌體，保存在-80℃環(huán)境中。用于電子顯微鏡觀察的外泌體保存在-4℃環(huán)境中。

6電鏡觀察對(duì)經(jīng)過(guò)離心收集到的來(lái)源于A549細(xì)胞的外泌體加入EM網(wǎng)格中，再加入1%戊二醛。使用乙酸雙氧鈾和甲基纖維素的混合物進(jìn)行背景染色。去除多余的液體后，80kV、JEOL 1200電子顯微鏡進(jìn)行觀察并記錄。

7用siRNA技術(shù)沉默基因表達(dá)用脂質(zhì)體2000作為轉(zhuǎn)染試劑，對(duì)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染P53 siRNA(siP53)或?qū)φ誷iRNA。P53 siRNA序列為5’-GATCCCCGACTCC-AGTGGTAATCTACT-TCAA

GAGAGTAGATTACCACTGGAGTCTTTTTGGA

AA-3’和 5’-AG-CTTTTC-CAAAAAGACTCCAGTGGTAATCTACTCTCTTGAAGTAGATT-A

CCACTGG-AGTCGGG-3’[5]。

8體內(nèi)實(shí)驗(yàn)使用裸鼠皮下移植瘤進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買BALB/c雄鼠，按規(guī)定進(jìn)行飼養(yǎng)，西安交通大學(xué)倫理委員會(huì)已批準(zhǔn)審核并批準(zhǔn)本實(shí)驗(yàn)。按2×107/0.1ml的密度將A549細(xì)胞接種于裸鼠后背左側(cè)。每?jī)商煊糜螛?biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，用公式(長(zhǎng)×寬2/2)計(jì)算腫瘤體積。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到80～100 mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分成兩組：二甲基亞砜(DMSO)與β-欖香烯組。對(duì)DMSO組裸鼠的腫瘤注射單純的DMSO，對(duì)β-欖香烯組裸鼠的腫瘤注射經(jīng)過(guò)20 μl DMSO稀釋的20 μg或者40 μgβ-欖香烯，每?jī)商爝M(jìn)行一次干預(yù)。每天測(cè)量一次腫瘤體積，持續(xù)20 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用CO2將裸鼠處死，利用RT-PCR試驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)分析。

9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。使用Dunnett法檢驗(yàn)不同組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1β-欖香烯在A549細(xì)胞中上調(diào)P53的表達(dá)見圖1。經(jīng)β-欖香烯干預(yù)，A549細(xì)胞中的P53 mRNA 和蛋白水平的表達(dá)均增加(圖1A)。這些結(jié)果提示β-欖香烯能夠上調(diào)A549細(xì)胞中的P53表達(dá)。進(jìn)一步用Western blot法對(duì)腫瘤源性的外泌體進(jìn)行了量化檢測(cè)(圖1B)。對(duì)培養(yǎng)過(guò)A549細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行系列離心后，提取出外泌體，用乙酸雙氧鈾和甲基纖維素的混合物進(jìn)行背景染色，電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)外泌體呈“杯狀”(圖1C)。Western blot顯示經(jīng)β-欖香烯處理A549細(xì)胞后，外泌體的標(biāo)志物CD63、flotillin-1以及Hsp70表達(dá)增加(圖1D)，提示β-欖香烯能夠促進(jìn)外泌體的分泌，經(jīng)β-欖香烯處理的A549細(xì)胞分泌出的外泌體的形態(tài)也并未發(fā)生變化。

2β-欖香烯對(duì)肺癌細(xì)胞的作用依賴于P53表達(dá) 見圖2。對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行siRNA干預(yù)，獲得siP53轉(zhuǎn)染組。siP53轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組相比，P53蛋白表達(dá)水平顯著下降(圖2A)。siP53轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖增加(圖2B)。Western blot顯示在siP53轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 和Bcl-xl表達(dá)變化不明顯(圖2C)。Western blot法檢測(cè)了外泌體的釋放，顯示在siP53轉(zhuǎn)染細(xì)胞中顯著下降(圖2D)。結(jié)果提示β-欖香烯在siP53轉(zhuǎn)染細(xì)胞中不能發(fā)揮抗腫瘤作用。

(Dunnett檢驗(yàn)，與對(duì)照組相比*P<0.05)

(Dunnett檢驗(yàn)，與對(duì)照組相比*P<0.05)

3腫瘤源性外泌體對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響見圖3。 使用MTT法檢測(cè)外泌體對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果提示A549細(xì)胞源性的外泌體能夠顯著抑制A549和H460細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖3A)，H460細(xì)胞源性的外泌體同樣能夠顯著抑制A549和H460細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖3B)。

(對(duì)照組相比*P<0.05)

4β-欖香烯在體內(nèi)抑制腫瘤的生長(zhǎng)見圖4。使用A549細(xì)胞構(gòu)建BABL/c裸鼠皮下移植瘤模型。腫瘤構(gòu)建成功后，用20 μg或者40 μg的β-欖香烯注射入腫瘤，每?jī)商爝M(jìn)行一次。觀察β-欖香烯能夠顯著抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)(圖4A)。P53、Hsp70， flotillin和CD36的mRNA表達(dá)水平經(jīng)β-欖香烯干預(yù)后顯著上調(diào)(圖4B和4C)。結(jié)果提示P53信號(hào)通路和外泌體均與β-欖香烯的抗腫瘤生長(zhǎng)有關(guān)。

(對(duì)照組相比*P<0.05)

討論

肺癌是是當(dāng)今最常見的惡性腫瘤，也是引起死亡的主要原因之一。手術(shù)、放療以及化療是目前肺癌患者的主要治療方法[6]。盡管目前在一些治療手段上取得了一些進(jìn)展，但治療效果仍不能夠滿意。近期β-欖香烯已被批準(zhǔn)用于肺癌的治療，前期研究也發(fā)現(xiàn)β-欖香烯在體內(nèi)外均具有抗腫瘤作用，然而其具體抗腫瘤機(jī)制仍不清楚。

眾所周知，β-欖香烯能夠促進(jìn)P53表達(dá)的上調(diào)，而P53的表達(dá)上調(diào)又與腫瘤抑制相關(guān)[7]，本課題前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，β-欖香烯的干預(yù)能夠顯著降低A549細(xì)胞的增殖，同時(shí)β-欖香烯能夠顯著下調(diào)Bcl-2 和Bcl-xl的表達(dá)，但對(duì)Bax 和Bak的表達(dá)影響較少。已有研究證實(shí)，抗腫瘤藥物可以通過(guò)P53依賴或者非依賴途徑引起細(xì)胞凋亡[8]。然而P53途經(jīng)在β-欖香烯誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡中的作用仍不清楚，為了探索P53在β-欖香烯作用中是否發(fā)揮作用，我們用siRNA構(gòu)造siP53轉(zhuǎn)染組，進(jìn)行后續(xù)的研究。在siP53轉(zhuǎn)染組，Bcl-2 和Bcl-xl的表達(dá)變化很少，提示β-欖香烯是通過(guò)P53依賴途徑誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。

我們發(fā)現(xiàn)β-欖香烯能夠上調(diào)腫瘤源性的外泌體的表達(dá)。一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞能夠分泌外泌體樣微泡，其中包含多種蛋白，例如CD63、熱休克蛋白、flotillin-1以及MHCⅠ類分子[9]，而腫瘤源性的外泌體在腫瘤發(fā)展過(guò)程中又起了重要的作用。目前的研究結(jié)果顯示β-欖香烯能夠通過(guò)P53依賴途徑上調(diào)外泌體的分泌。因此，我們推測(cè)β-欖香烯主要通過(guò)兩種途徑來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。一種是β-欖香烯通過(guò)上調(diào)P53和下調(diào)Bcl-2 和Bcl-xl以激活凋亡相關(guān)途徑，另一種是外泌體依賴途徑。為了探索腫瘤源性外泌體的生物學(xué)功能，對(duì)培養(yǎng)經(jīng)β-欖香烯干預(yù)過(guò)的A549細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行一系列離心分離，提取出外泌體，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞源性的外泌體有典型的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，直徑在30～100 nm。進(jìn)一步探索A549細(xì)胞源性的外泌體是否能夠影響肺癌細(xì)胞的增殖，發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞源性的外泌體可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖。然而，有些文獻(xiàn)報(bào)道BT-474源性的外泌體促進(jìn)了BT-474的增殖[10]，這些證據(jù)提示腫瘤源性的外泌體有抗腫瘤及促進(jìn)腫瘤的雙重作用，而出現(xiàn)這些有爭(zhēng)議的結(jié)果可能是因?yàn)橥饷隗w、應(yīng)答細(xì)胞及環(huán)境三因素之間復(fù)雜的作用關(guān)系所致[11]。

本研究中仍存在一些局限性，本研究中，體外研究使用劑量為200 μM的β-欖香烯，體內(nèi)的研究中則將計(jì)量為20 μg的β-欖香烯溶解于20 μl的DMSO中用于研究，而以上β-欖香烯的劑量是否可以直接用于人體仍需進(jìn)一步探討。

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(收稿：2015-06-08)

【中圖分類號(hào)】R734.2

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.02.003

*陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012JC2-06)

△西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所

▲通訊作者