EGB761對人子宮頸癌Siha細胞株的促凋亡作用

陜西中醫藥大學第二附屬醫院(咸陽712000)　洪玉鋒　 孫　蓓

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EGB761對人子宮頸癌Siha細胞株的促凋亡作用

陜西中醫藥大學第二附屬醫院(咸陽712000)洪玉鋒 孫蓓

摘要目的：研究銀杏葉提取物EGB761對人子宮頸癌Siha細胞的促凋亡作用。方法：EGB761干預人子宮頸癌Siha細胞后，CCK-8觀察 50、100 和200 mg/L不同濃度EGB761作用下人子宮頸癌Siha細胞的增殖狀況，流式細胞儀分析用AnnexinV-FITC和PI雙染檢測不同濃度EGB761對人子宮頸癌Siha細胞凋亡的影響。結果： EGB761可抑制人子宮頸癌Siha細胞的增殖，呈濃度和時間依賴性反應；EGB761 100 mg/L、200 mg/L干預人子宮頸癌Siha細胞后，流式細胞儀檢測顯示細胞凋亡率明顯升高(P<0.01)。結論：EGB761可誘導人子宮頸癌Siha細胞凋亡。

主題詞子宮頸腫瘤銀杏葉細胞凋亡@EGB761@Siha細胞株

迄今為止，子宮頸癌仍是排第二位的婦科腫瘤，是導致婦女死亡的主要惡性疾病之一。Siha細胞屬于鱗癌細胞株的其中常見的一類，其染色體中有基因組整合的人乳頭狀瘤病毒(HPV)16，所以被經常用來研究宮頸癌。銀杏葉是臨床常用的心血管疾病藥物，其主要功效是化濁降脂、活血化瘀、斂肺平喘、通絡止痛[1]。其純化由德國Schwabe制藥公司于20世紀完成，產品編號為EGB761，不僅如此，該公司還進一步對其標準的制定進行了研究，對銀杏葉的廣泛應用及應用標準起到了很大的作用。EGB761能提高超氧化物歧化酶(SOD)的活性，并對自由基的清除有一定作用，可能與其24%的黃酮苷和6%的萜內酯有一定相關性。近年來有學者研究發現EGB761可以抑制腫瘤的生長速度，其作用及機制可能與促進腫瘤細胞的凋亡相關，并進一步借此對腫瘤進行實驗治療[2]。人子宮頸癌被認為是危害婦女身體的最嚴重的疾病之一，臨床對其治療效果并不十分理想，如何抑制其腫瘤細胞的生長成為現階段的研究熱點之一。本實驗擬通過觀察EGB761對Siha細胞有無凋亡作用，判定EGB761抑制腫瘤的作用，為臨床EGB761對宮頸癌的治療提供實驗室數據支持。

材料與方法

1材料南京博瑞公司購買銀杏葉提取物EGB761，用DMSO稀釋成所需濃度；碧云天生物技術研究所購買細胞凋亡與壞死檢測試劑盒；細胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發展有限公司；武漢博士德生物工程有限公司購買標準胎牛血清、胰蛋白酶溶液、DMEM高糖液體培養基和細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒。

2方法①細胞培養：宮頸癌細胞珠 Siha分別用MEM、RPMI-1640 完全培養液常規培養；在 37 ℃ 室溫，5% CO2恒溫箱孵育；取對數生長期細胞實驗。②CCK-8 檢測抑制細胞增值率：宮頸癌Siha細胞珠制成懸液(對數生長期)，96孔板接種，100 μl/孔，培養箱培養24 h(37 ℃、5% CO2)；每孔加EGB761(0.5 mg/ml)12、20、30、40、50 μl， 5 孔重復；對照組為等量的DMSO；空白孔調零；12、24、48 h分別處理，加入10 μl/孔CCK-8，4 h；空白對照調零，各孔吸光度(OD)值檢測(酶標儀450 nm波長)，測 3 次，取平均值，公式如下：細胞增殖抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%計算抑制率。③流式細胞儀膜聯蛋白V、異硫氰酸熒光素和碘化丙啶雙染檢測凋亡率：采取對數生長期的宮頸癌Siha細胞珠制成懸液，接種于96孔板，每孔100 μl/孔；24 h培養箱培養(條件37 ℃、5% CO2)，EGB761(0.5 mg/ml)分別加12、20、30、40、50 μl， 5 孔重復，置冰浴；細胞懸液中加入AnnexinV-FITC和PI各5 μl；4 ℃避光染色15 min；流式細胞儀進行檢測，計算細胞凋亡的百分比(緩沖液混懸細胞補充至500μl)。

結果

1CCK- 8 檢測細胞增殖活性見表1。與對照組相比，小劑量EGB761(50 mg/L)對Siha細胞的增殖影響無統計學意義(P>0.05)。而中、大劑量EGB761(100和 200 mg/L)作用 12 h、24 h、48 h，抑制了宮頸癌細胞珠 Siha細胞的增殖(P<0.01)，并與濃度與作用時間成正相關(P<0.05)。

表1　倍增劑量EGB761倍增時間Siha

注：與對照組比較，*P<0.05

2利用流式細胞儀Annexin-VFITC/PI 雙染法檢測細胞凋亡率見表2。與對照組比較，EGB761(50 mg/L)作用后無變化(P>0.05)，EGB761(100、200 mg/L)能夠增加Siha細胞的凋亡率。并與濃度的增高呈現劑量依賴關系(P<0.01)。

表2　不同濃度EGB761誘導Siha細胞凋亡

注：與對照組比較，*P<0.05

討論

EGB761是從銀杏葉中經多個步驟分離、純化而提取出的一種標準化的銀杏葉提取物制劑，實驗證明EGB761能夠抑制腫瘤血管的形成，其機制可能與增強機體抗氧化能力有關[3]。而且，腫瘤的發生理論認為，其生長不僅與體內氧自由基的產生有關，而且還和氧自由基的清除障礙密切相關[4]。相關研究還證明，EGB761不僅能夠對淋巴細胞線粒體脫氫酶的活性有增強作用，還能增加中性粒細胞過氧化酶的釋放，通過這樣的機制，提高機體細胞的免疫功能，進而對腫瘤的生長起抑制作用，并且與作用的時間以及濃度正相關[5]。根據現代腫瘤的發生理論，細胞凋亡在腫瘤的發生發展中起到了不可替代的作用，凋亡是生命的基本特征之一，細胞凋亡受阻與腫瘤的發生有很大關系[6]。對于細胞的增殖的抑制及促進凋亡可以對腫瘤的生長起抑制作用。而多項實驗研究結果均顯示EGB761能夠完成上述作用。原因可能有以下幾個方面：①銀杏總黃酮有清除氧自由基的活性，有實驗發現銀杏葉能夠抑制人肝癌HepG2細胞的增殖，其原因正是通過誘導細胞調亡來完成的[7]；②黃酮類化合物能夠阻礙腫瘤組織中的脂肪物質的合成，利用該機制使瘤細胞凋亡數目增多，從而降低腫瘤生長速度[8]，該理論也通過實驗得到證實，有研究證明EGB761可以抑制人乳腺癌及前列腺癌細胞系中的FAS；③P53基因與腫瘤的發生密切相關，有實驗證明EGB761可以提高該基因的表達，通過升高癌細胞的凋亡率降低腫瘤的生長速度[9-10]。

本實驗結果表明，EGB761能夠有效誘導宮頸癌相關Siha細胞株的凋亡，從而達到抑制宮頸癌發生發展的速度并與劑量以及時間呈正相關。為臨床宮頸癌的治療新思路提供了循證學證據。

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(收稿：2015-05-11)

Effection of EGb 761 to apoptosis of cervical carcinoma siha cell in vitro

The Second Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine(Xianyang 712000)

Hong YufengSun Bei

ABSTRACTObjective：To explore the contribution of EGB761 to the proliferation and apoptosis of Cervical Carcinoma Siha cell in vitro. Methods：CCK-8 assay was used to measure 50、100 and 200 mg/L which its effects on the proliferation of Cervical Carcinoma Siha cell cultured with different concentrations of allicin for 12 h，24 h，48 h，AnnexinV-FITC and PI assay by flow cytometer (FCM) were applied to detect the apoptosis induced by EGB761.The changes of cell cycle were detected by FCM. Results：EGB761 suppressed the proliferation of Cervical Carcinoma Siha cell in a concentration-and time-dependent manner EGB761 induced cellular apoptosis of the Cervical Carcinoma Siha cell in a concentration-dependent manner.With EGB761 100，200 mg/L intervention Cervical Carcinoma Siha cell， flow cytometer (FCM) test showed that the cell apoptosis rate increased significant (P<0.01). Conclusion：EGB761 significantly suppresses the growth of Cervical Carcinoma Siha cell， induces the apoptosis of Cervical Carcinoma Siha cell. Therefore resveratrol may be considered as a possible treatment medicine for Cervical Carcinoma .

KEY WORDSUterine cervical neoplasmsFolium ginkgoApoptosis@EGB761@Siha cell

【中圖分類號】R737.33

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.02.008