BDNF與腦缺血嚴重程度的相關性研究*

西安交通大學第二附屬醫院神經內科(西安 710004)

鄭少微　展淑琴▲　張凌峰　高亞亞　鞏付華　吳海琴　張桂蓮　范清雨　翟躍芬

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BDNF與腦缺血嚴重程度的相關性研究*

西安交通大學第二附屬醫院神經內科(西安 710004)

鄭少微展淑琴▲張凌峰高亞亞鞏付華吳海琴張桂蓮范清雨翟躍芬

摘要目的：研究腦源性神經營養因子(BDNF)與腦缺血嚴重程度的關系。方法：制作大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)模型，于30 min MCAO及100 min MCAO后再灌注4 h、8 h、24 h后取大鼠腦組織進行BDNF免疫組織化學染色，觀察缺血腦皮層內BDNF陽性細胞所占比例，并與假手術對照組比較。結果：30 min MCAO組再灌注4 h、8 h、24 h與假手術對照組比較缺血腦皮層BDNF陽性細胞所占比例無明顯差異(P>0.05)；100 min MCAO再灌注4 h、8 h、24 h組與假手術對照組比較缺血腦皮層BDNF陽性細胞所占比例增加，差異有統計學意義(P<0.05)。結論：腦組織缺血可導致缺血神經元BDNF表達明顯增加。

主題詞腦缺血梗塞，大腦中動脈腦源性神經營養因子免疫組織化學

在我國腦卒中做為常見疾病，具有高病死率、高致殘率，因此，關于腦卒中的預防與治療成為當今研究的熱點。腦源性神經營養因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是腦細胞生成和分泌的一種神經營養因子，具有提高神經元存活、分化及再生的作用，與學習、記憶方面的突觸可塑性密切相關[1-5]，而且BDNF與心境障礙、精神分裂等精神疾病的發生密切相關[6-8]。在動物腦缺血模型中，BDNF表現出明顯的腦保護作用[9]。本文通過大鼠腦缺血模型中BDNF的表達情況，探討BDNF與腦缺血嚴重程度之間的關系，為治療缺血性腦血管病提供新的理論指導。

材料與方法

1材料健康成年雄性SD大鼠100 只，體重250～300 g，8周齡左右，由西安交通大學動物實驗中心提供。兔抗BDNF及免疫組化試劑購自武漢博士德。尼龍線頭端經特殊燒制而成，線栓長度為35 mm，光滑并大小一致，在20 mm處做標記，以便測量進入頸內動脈的長度，線栓經酒精消毒后備用。試驗器械及試劑主要有：酒精棉球，碘伏，棉簽，眼科剪，眼科鑷，動脈夾，自制拉鉤，4-0手術線，生理鹽水，10%水合氯醛，4%多聚甲醛，25%及30% 蔗糖溶液，冰凍組織切片機。

2方法①大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)模型：用線栓法建立大鼠MCAO模型[10]。將100只大鼠隨機分為MCAO組80只，對照組20只，其中30 min MCAO亞組40只，100 min MCAO亞組40只，對應30 min假手術亞組10只，100 min假手術亞組10只。10%水合氯醛按0.35 ml/100g經腹腔注射，5～8 min麻醉完全，肌肉松弛后，將大鼠仰臥位固定于手術臺上，剪去頸前區毛發，消毒手術區皮膚；沿頸部正中切開皮膚，鈍性分離皮下組織， 用自制拉鉤分別向兩邊牽引胸骨乳突肌和胸骨舌骨肌，完全暴露頸總動脈(CCA)，頸內動脈(ICA)，頸外動脈(ECA)；游離血管后，在距ECA 和 ICA 分叉0.5 cm 處結扎CCA，結扎 ECA，動脈夾夾閉 ICA；用眼科剪在 CCA近ICA處剪一小口，將線栓插入ICA，松開動脈夾，將線栓繼續向前推進，直到感到阻力后停止，測量進入ICA的線栓長度，距分叉處約18～19 mm，結扎ICA止血，固定線栓；插入線栓開始計時，分別在30 min，100 min后拔出線栓，大腦中動脈供血區可得到前交通動脈、后交通動脈的血供形成再灌注，在再灌注4h、8h、24h 后經心臟灌注生理鹽水及4%多聚甲醛(0.1M，pH 7.4)后取腦，4℃分別置于4% 多聚甲醛、25%及30% 蔗糖溶液沉底后行冠狀凍切，片厚12 μm，-80℃保存。對照組不行線拴及動脈結扎，余同MCAO 組。②BDNF免疫組織化學染色：室溫晾干切片后經4%多聚甲醛固定及3% H2O2、5%BSA處理后加一抗(1:200)4 ℃過夜，用生物素化羊抗兔IgG于37 ℃孵育20 min后滴加SABC試劑，37℃孵育20 min，DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸酒精分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。③計數：每張BDNF免疫組化切片上隨機選擇5個200×的視野，人工計數每張視野中BDNF陽性細胞(胞漿染色棕色)占所有帶核細胞個數的比值。

3統計學方法所得數據采用SPSS 18.0統計軟件包進行統計學處理。動物試驗中，計算各個組的各個時間段BDNF陽性細胞所占比例，采用獨立樣本資料的t檢驗計算，P<0.05為差異有統計學意義。

結果

BDNF陽性細胞胞漿呈棕黃色。30 min MCAO組再灌注4 h、8 h、24 h，與30 min假手術對照組比較缺血腦皮層BDNF陽性細胞所占比例無明顯差異(P>0.05)(表1)；而100 min MCAO組與100 min假手術對照組比較，可見再灌注4 h、8 h、24 h時缺血腦皮層BDNF陽性細胞所占比例較對照組明顯增加(P<0.05)(表2)，尤其在8 h增加為著。

表1　30 min MCAO再灌注后不同時間點大鼠

表2　100 min MCAO再灌注后不同時間點

注：與假手術組比較，*P<0.05

討論

缺血缺氧導致的腦神經元凋亡是導致腦梗死后病人運動、感覺等功能難以恢復的主要原因，減少腦梗死患者腦神經元的凋亡或者促進其重生可以極大的改善腦梗死患者預后。目前動物研究表明BDNF具有抗神經元凋亡及刺激神經元再生，從而改善腦缺血預后的作用[11]。大鼠腦梗死后靜脈注射BDNF，其可通過血腦屏障到達缺血部位發揮抗神經元凋亡、刺激神經元重生的作用，提高腦梗死后運動及感覺功能的能恢復[12]。一項長達10年的臨床隨訪試驗結果表明低濃度BDNF水平是增加中風事件的危險因素，而高濃度BDNF水平表現出少的腦白質缺血及好的視覺記憶[13]。BDNF還可做為評價老年女性記憶及一般認知功能損害程度的生物學標志物[14]。本文通過動物試驗，表明在腦組織缺血導致的神經元損害時BDNF表達明顯增加。

動物試驗中，30 min MCAO組較假手術組BDNF陽性細胞比例無明顯增加，而100 min MCAO組中BDNF陽性細胞明顯增加并且細胞胞漿染色明顯增濃，在再灌注8h增加尤其明顯。這表明神經元損傷越是嚴重，BDNF的表達越高，而且在最初幾小時BDNF表達緩慢增加，而之后出現BDNF表達快速增加。根據目前研究表明BDNF是腦神經元含量較多的神經肽，參與神經元發育、分化、生長以及學習與記憶，同時本試驗說明BDNF也參與腦缺血再灌注損傷。在腦組織損傷數小時內，BDNF高表達參與機體抗凋亡機制，減輕神經元損傷程度，有利于改善腦卒中預后，但BDNF參與神經元保護的作用機制還不清楚。BDNF對酪氨酸激酶受體B(tyrosin-kinase receptor B，TrkB)高親和，而TrkB廣泛存在中樞神經系統突觸后膜。脊髓損傷后通過鞘內注射或病毒轉導或干細胞移植使脊髓內BDNF表達增多，明顯提高神經元及軸突的成活，而使用TrkB受體抑制劑或其表達阻滯，神經元恢復明顯受抑制[15]。BDNF結合全長型TrkB，使TrkB受體二聚體化，胞漿內酪氨酸殘基磷酸化和胞內段的酪氨酸激酶區域活化，可以激活下游的分裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶(MAPK/ERK)，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)和磷脂酶c(PLC-γ)等信號通路，從而發揮調節神經元生長、分化、再生等生理作用[16]。BDNF的神經元保護作用是其研究一大熱點，但具體作用機制有待進一步研究。雖然BDNF具有腦保護作用，但嚴重腦缺血事件導致被損害組織在24 h內BDNF高表達，即刻的外源途徑增加BDNF濃度來治療腦卒中疾病是否必要，這個值得我們思考。

本研究表明腦缺血性損傷可以使BDNF表達增加。目前，BDNF的抗神經細胞凋亡及刺激神經元再生的機制還不是很清楚。希望本研究可以拋磚引玉，有待今后的大規模臨床試驗印證BDNF的腦保護作用及其作用機制。當下腦梗死沒有特效藥物治療的情況下，新型藥物的研究和研發成為今后的一大熱點。希望本試驗能為腦梗死的治療提供新的理論指導。

參考文獻

[1]Leal G，Comprido D，Duarte CB.BDNF-induced local protein synthesis and synaptic plasticity[J]. Neuropharmacology，2014，76(Part C)：639-656.

[2]Bekinschtein P， Cammarota M， Medina JH. BDNF and memory processing[J]. Neuropharmacology，2014， 76(Part C)：677-683.

[3]巴迎春，段艷萍，王金德，等.內源性BDNF促進受損神經系統再生的實驗研究[J].四川大學學報：醫學版，2009，40(3)：418-421.

[4]Ruiz CR，Shi J，Meffert MK.Transcript specificity in BDNF-regulated protein synthesis[J]. Neuropharmacology，2014，76(Part C)：657-663.

[5]Novkovic T，Mittmann T，Manahan-Vaughan D.BDNF contributes to the facilitation of hippocampal synaptic plasticity and learning enabled by environmental enrichment[J].Hippocampus，2015，25(1)：1-15.

[6]Polyakova M，Stuke K，Schuemberg K，etal.BDNF as a biomarker for successful treatment of mood disorders：A systematic & quantitative meta-analysis[J].Journal of Affective Disorders，2014，174：432-440.

[7]Wu JQ，Chenda C，Tan YL，etal.Altered BDNF is correlated to cognition impairment in schizophrenia patients with tardive dyskinesia[J].Psychopharmacology，2015，232(1)：223-232.

[8]Wu JQ，Chenda C，Tan YL，etal.Decreased plasma levels of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) during mixed episodes of bipolar disorder[J].J Affect Disord，2015，171：167-170.

[9]Ploughman M，Windle V，MacLellan CL，etal.Brain-derived neurotrophic factor contributes to recovery of skilled reaching after focal ischemia in rats[J].Stroke，2009，40(4)：1490-1495.

[10]展淑琴，高亞亞，張凌峰，等.大鼠大腦中動脈永久性缺血和缺血再灌注模型的比較[J].陜西醫學雜志，2013，42(6)：643-646.

[11]Jeong CH，Kim SM，Lim JY，etal.mesenchymal stem cells expressing brain-derived neurotrophic factor enhance endogenous neurogenesis in an ischemic stroke model[J].Biomed Res Int，2014，2014：129-145.

[12]Schabitz WR，Steigleder T，Cooper-Kuhn CM，etal.Intravenous brain-derived neurotrophic factor enhancespoststroke sensorimotor recovery and stimulates neurogenesis[J].Stroke，2007，38(7)：2165-72.

[13]Pikula A，Beiser AS，Chen TC，etal.Serum brain-derived neurotrophic factorand vascular endothelial growth factor levels are associated with risk of stroke and vascular brain injury[J].Stroke，2013，44(10)：2768-27675.

[14]Pluchino N，Russo M，Santoro AN，etal.Steroid hormones and BDNF[J].Neuroscience，2013，239：271-279.

[15]Mantilla CB， Gransee HM， Zhan WZ，etal. Motoneuron BDNF/TrkB signaling enhances functional recovery after cervical spinal cord injury[J].Experimental Neurology，2013，247：101-109.

[16]張芳，周新富，肖志成.BDNF/TrkB通路與β-淀粉樣蛋白的關系研究進展[J].中華神經醫學雜志，2013，12(8)：857-859.

(收稿：2015-05-05)

The Relationship between BDNF and the severity of cerebral ischemia

The Department of Neurology，the Second Affiliated Hospital of Xi’an

Jiaotong University(Xi’an 710004 )Zheng ShaoweiZhan ShuqinZhang Lingfenget al

ABSTRACTObjective：To discuss the relationship between BDNF and the severity of cerebral ischemia.Methods：The models of rats middle cerebral artery occlusion (MCAO) were made and the rats’ brains were gotten at 4 h、8 h and 24 h reperfusion after 30 minutes MCAO and 100 minutes MCAO respectively. The proportion of BDNF positive cells in ischemic rats cortices were analysised by immunohistochemical staining and compared with those of sham groups.Results：There were no significant differences(P>0.05)in the proportions of BDNF positive cells at 4 h，8 h and 24 h reperfusion after 30 minutes MCAO compared with those of the sham group. However，the proportions of BDNF positive cells at 4 h， 8 h and 24 h reperfusion after 100 minutes MCAO were higher compared with those in the corresponding sham group (P<0.05). Conclusion：The expression of BDNF significantly increased in ischemia neurons.

KEY WORDSCerebral ischemiaInfarction，middle cerebral arteryBrain-derived neurotrophic factorImmunohistochemical

【中圖分類號】R743.32

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.02.013

*國家自然科學基金資助項目(81070999)

中央高校基本科研業務費專項資金資助(xjj2014153，2009-95)

西安交通大學第二附屬醫院人才培養專項科研基金科技骨干

項目[RC (GG)201109]

▲通訊作者