抑制辣椒炭疽菌的生防芽孢桿菌菌株篩選和鑒定*

喇文軍，賈書娟，吳小麗，曾大興（深圳職業技術學院 應用化學與生物技術學院，廣東 深圳 518055）

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抑制辣椒炭疽菌的生防芽孢桿菌菌株篩選和鑒定*

喇文軍，賈書娟，吳小麗，曾大興*
（深圳職業技術學院 應用化學與生物技術學院，廣東 深圳 518055）

摘 要：從植物根際土壤分離篩選獲得的芽孢桿菌C-D6菌株對辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）顯示明顯的抑制作用.通過形態觀察、16S rDNA序列同源性分析以及tetB-tetL基因特異序列擴增，鑒定該菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）.實驗結果表明：C-D6菌株在PDA平板上對辣椒炭疽菌、尖孢鐮刀菌、苞葉芋柱帚霉和煙草疫霉等多種重要植物病原真菌具有明顯的拮抗作用.顯微觀察發現：C-D6菌株的細菌培養液對辣椒炭疽菌的附著胞形成具有強烈的抑制作用.表明該菌株對辣椒炭疽菌引起的炭疽病的生物防治具有潛在的應用價值.

關鍵詞：枯草粉芽孢桿菌；辣椒炭疽菌；附著胞形成

辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）引起辣椒黑點炭疽病，是辣椒果實的主要病害之一，可造成辣椒減產甚至絕收，并嚴重影響辣椒品質[1].此外，該菌分布廣泛，在華南地區可危害多種蔬菜、花卉、藥用植物和大田作物，引起爛果、枯枝和葉斑等癥狀，對農林生產造成嚴重危害[2-3].化學防治和選用抗病品種是作物真菌病害的主要防治途徑，在各種炭疽病的防治上也廣泛采用.然而，由于化學防治易使病原菌產生抗藥性，污染環境和農產品，導致抗病品種易退化等原因，使多種炭疽病處于較難防治的困境.

生物防治因其具有無毒無害、無污染、不產生抗藥性和持續高效等優點，符合農業可持續發展的要求，是當前和未來植物病害綜合防治的發展方向.植物病害生物防治的研究策略是從自然界篩選拮抗微生物，利用其營養競爭、重寄生、誘導抗性及產生抗生素、水解酶等多種方式作用于病原菌，殺死病原菌或抑制其菌絲生長，從而實現病害防治目的[4].應用拮抗細菌及其產生的抗菌物質開展炭疽病的生物防治研究取得了一些進展[5-6].然而，以抑制病原菌生長或直接殺死病原菌的傳統生防策略對于炭疽病的防治存在明顯的局限，原因是炭疽病為潛伏侵染病害，其潛伏侵染的菌絲會受到植物的保護而使生防因子不能作用[7].

為探索炭疽病新的生物防治途徑，我們以辣椒炭疽菌侵入循環中的附著胞形成為靶點，建立了快速篩選抑制附著胞形成的細菌菌株的實驗方法[8].通過大量篩選工作，從一份土壤樣品中獲得了一株能明顯抑制該菌附著胞形成，并具有廣譜抗菌性的芽孢桿菌菌株.本文給出該菌株的篩選、鑒定及對辣椒炭疽菌的抑菌特征.

1　材料與方法

1.1菌株

芽孢桿菌C-D6菌株從安徽省旌德縣采集的農田土壤分離篩選獲得.供試病原菌：辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）501、希金斯炭疽菌（C.higginsianum）CGZ-1、膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）Mg1、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）F2，FDC-4、稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）SD-3、煙草疫霉（Phytophthora nicotianae）DBL-1、苞葉芋柱帚霉（Cylindrocladium spathiphylli）Zh-20和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）RH-5.膠孢炭疽菌、希金斯炭疽菌和煙草疫霉菌株由深圳職業技術學院微生物室分離保存；辣椒炭疽菌、尖孢鐮刀菌和稻瘟病菌等菌株由華南農業大學植病系真菌研究室贈送.

1.2培養基

PDA培養基：馬鈴薯 200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂 20 g/L.酵母膏蛋白胨培養基（YPD）：酵母膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖10 g/L.牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏 3 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 5 g/L.PDA培養基為天然pH，其余培養基pH為7.0～7.2.

1.3菌株的篩選

菌株篩選參照文獻[8]的方法進行，即采用稀釋平板分離法分離土壤細菌，分離培養基為牛肉膏蛋白胨培養基，分離平板37℃恒溫培養24 h后，挑起單菌落轉接到的96孔板中（每孔含200μL YPD培養基），37℃培養18~24h后，取20μL培養液與含300U/mL青霉素和300μg/mL硫酸鏈霉素的等量炭疽菌孢子懸液（1×106/mL）混合后，滴加到載片中央，25℃保濕培養，10~12h后進行顯微觀察，選取抑制附著胞形成的菌株為初篩菌株.初篩菌株接種到YPD培養基中，37℃，250r/min搖床培養24h后，離心收集培養液，過濾除菌后，用上述載片培養方法進行3輪復篩.選取抑制率高和作用效果穩定的菌株為目標菌株.

1.4細菌的形態特征觀察

將C-D6菌株劃線接種到牛肉膏蛋白胨培養基上，37℃培養18h后，觀察菌落形態；取樣涂布制片，進行革蘭氏染色，觀察菌體形態，測量其大小.

1.5菌株C-D6的16SrDNA序列分析

采用AxyPrep基因組DNA小量試劑盒（Axygen 公司）提取菌株C-D6的基因組DNA.以基因組DNA為模板，細菌通用引物8F （5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R （5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′）為擴增引物，PCR擴增16S rDNA片段.PCR 反應體系選用25μL反應體系，擴增條件為：95℃ 5 min；95℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min，40循環；72℃ 10 min.擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托上海生工生物技術有限公司進行測序，將測序結果提交GenBank 核酸序列數據庫，通過BLAST搜索比對進行序列同源性比較.采用MEGA3.1軟件構建系統發育樹.

1.6菌株C-D6的特異性基因序列擴增

選用Reva設計的兩對芽孢桿菌特異引物（YyaO-F/TetB-R 和 YyaR-F/TetB-R）對菌株C-D6進行特異片段擴增[10].引物序列為：

引物由上海生工合成，PCR反應體系及條件參照文獻[9]的方法進行.采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果.

1.7菌株C-D6的抗菌譜測定

菌株C-D6的抗菌譜測定參照文獻[9]的方法進行，即從25℃培養約7d的病原菌，菌落邊緣切取直徑為6.5 mm的圓形小菌，塊置于PDA平板中央，在其2邊2.5 cm處對稱接入C-D6，25℃培養7d后，測定其抑菌帶寬度.每處理3次重復.

2　結果與分析

2.1菌株C-D6的分離篩選

以抑制辣椒炭疽菌附著胞形成為篩選目標，從廣東、海南、湖南、安徽和江西等省部分地區采集的69份土樣篩選有效菌株.通過載片混合培養篩選，從1152個細菌分離菌株中，共獲得126個抑制辣椒炭疽菌附著胞形成或影響附著胞形態的初篩菌株，有效菌株占10.94%.初篩菌株經3輪復篩，共獲得25個對辣椒炭疽菌附著胞形成有明顯影響的細菌菌株，其中包括抑制附著胞形成的菌株16個，影響附著胞形態的菌株9個，前者的YPD培養液能明顯抑制附著胞形成，后者的YPD培養液使辣椒炭疽菌形成膨大、中空、色淺的無效附著胞.進一步的實驗測定發現分離自安徽省旌德縣農田土壤的C-D6菌株，在相同稀釋條件下對抑制炭疽菌附著胞形成的作用效果優于其它菌株，且作用效果穩定（見圖1），選定為本研究的目標菌株.

圖1　菌株C-D6培養液對辣椒炭疽菌附著胞形成的抑制作用

2.2菌株C-D6的鑒定

2.2.1菌株C-D6的形態特征

菌株C-D6在牛肉膏蛋白胨培養基上37℃培養18h，形成乳白、表面粗糙有皺褶、邊緣整齊的圓形突起菌落；菌體桿狀，大小為0.89μm×2.74μm.經革蘭氏染色后觀察：芽孢中生，橢圓，孢囊不膨大.革蘭氏染色陽性.

2.2.2菌株C-D6的16S rDNA序列特征

采用優化的擴增條件，從C-D6的基因組DNA擴增獲得一條16S rDNA片段，測得該片段序列長度為1691bp.將測定序列提交Genbank進行搜索比對，結果顯示：該序列與Genbank中的2個枯草芽孢桿菌參考菌株L4和WD23 （登陸號分別為：GQ421472和EU780682)的序列同源性大于99%.從Genbank中選擇了8個芽孢桿菌菌株的16SrDNA基因序列，應用MEGA3.1進行多重比較后構建的系統發育樹見圖2.結果表明：菌株C-D6與枯草芽胞桿菌的親緣關系最近.

圖2　C-D6基于16SrDNA序列的系統發育樹

2.2.3菌株C-D6的特異性基因序列分析

分別用兩對芽孢桿菌特異引物YyaO-F/TetB-R和YyaO-F/TetB-R對C-D6菌株的基因組DNA進行PCR擴增.結果顯示：當以YyaO-F/TetB-R為引物時，C-D6能擴增獲得一條大約600bp的DNA片段，以YyaR-F/TetB-R為引物時，C-D6不產生擴增產物（見圖3）.

YyaO-F/TetB-R和YyaR-F/TetB-R是Reva基于編碼轉運蛋白基因（tetB-tetL）的序列差異而設計的用于鑒別枯草芽胞桿菌和解淀粉芽孢桿菌的特異引物[10].YyaO-F/TetB-R擴增陽性，YyaR-F/TetB-R擴增陰性為枯草芽胞桿菌，反之為解淀粉芽孢桿菌.因此，上述實驗結果支持將C-D6鑒定為枯草芽胞桿菌.結合形態特征和16SrDNA序列分析，將菌株C-D6鑒定為枯草芽孢桿菌.

2.3菌株C-D6的抗菌譜測定

用對峙培養法測定了菌株C-D6對辣椒炭疽菌、尖孢鐮刀菌和稻瘟病菌等重要植物病原真菌的抑制作用，結果見表1.結果顯示：拮抗菌株C-D6對尖孢鐮刀菌、膠孢炭疽菌、辣椒炭疽菌、苞葉芋柱帚霉、煙草疫霉和稻瘟病菌都有明顯的抑制作用，其抑菌帶寬度在17.54~27.66mm之間，其中對尖孢鐮刀菌抑菌效果最好，抑菌帶寬度高達27.66mm，僅對立枯絲核菌沒有作用.由此可見，拮抗菌株C-D6抗菌譜較寬，對多種病害的生物防治具有應用潛力.

圖3　C-D6菌株的特異性基因序列PCR擴增圖譜

表1　枯草芽孢桿菌C-D6菌株的抗菌譜測定

3　討 論

炭疽菌侵入寄主植物的過程極其復雜，包含分生孢子黏附在寄主表面、孢子萌發、附著胞形成、附著胞黑色素化及產生侵入釘直接侵入寄主組織等一系列重要步驟.其中附著胞的形成是侵染過程中的關鍵環節，對病害的發生非常重要[11].Kim等的研究證實在大腸桿菌內表達的辣椒酯酶能抑制膠孢炭疽菌附著胞的形成，從而可控制病害的發生[12].為探索炭疽病生物防治的新途徑，我們以辣椒炭疽菌侵入循環中的附著胞形成為靶點，開展抑制附著胞形成的生防細菌篩選，通過大量篩選工作，獲得了一株能明顯抑制辣椒炭疽菌附著胞形成，并具有廣譜抑菌作用的新型芽孢桿菌生防菌株C-D6.芽孢桿菌具有生長快、耐熱及抗逆性強等突出特點，有利于生防菌劑生產及生防菌在環境中的存活、定殖與繁殖，是一種理想的生防微生物[13]，已廣泛應用于植物病害的生物防治[5,6,14].

基于形態觀察和生理生化試驗的傳統細菌鑒定方法不僅繁瑣耗時，而且不能有效區分多種細菌的近緣種.因此，細菌的分類鑒定越來越依賴于分子生物學方法.16S rDNA序列分析是一種廣泛應用于細菌鑒定的分子方法，通過序列比對和同源性分析可將菌株快速鑒定到屬，甚至種[15].然而，有研究表明芽孢桿菌的一些種具有極高的16S rDNA序列相似值，這一方法不適用于這些芽孢桿菌種的鑒定.為此，其它一些基因，如gyrA、gyrB、polC和tetB(L)等被引入芽孢桿菌種的分類鑒定，并證明完全有效[16].這些序列的種間差異還為種特異引物的設計提供豐富的序列信息.Reva等研究發現：枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的tetB(L)基因存在序列結構差異，并據此設計兩對特異引物YyaO-F/TetB-R和YyaR-F/TetB-R，分別用于枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的快速鑒定[10].在本研究中，菌株C-D6的16S rDNA序列與GenBank數據庫中的枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌等多個種的序列相似性均大于99%，據此不能準確確定該菌株的分類地位.進一步采用種特異引物YyaO-F/TetB-R和YyaR-F/TetB-R對菌株C-D6進行擴增，實驗結果支持將該菌株鑒定為枯草芽孢桿菌，結合形態特征和16S rDNA序列分析結果，最終將菌株C-D6鑒定為枯草芽孢桿菌.菌株C-D6的篩選獲得、鑒定和抑菌特征研究，為進一步研究其生防機理和開發新型生防制劑奠定了基礎.

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*項目來源：深圳市基礎研究計劃資助項目（No. JC201105201186A）

Screening and Identification of an Antagonistic Bacillus sp. Against Colletotrichum Capsici

LA Wenjun, JIA Shujuan, WU Xiaoli, ZENG Daxing
（School of Applied Chemistry and Biological Technology, Shenzhen Polytechnic, Shenzhen, Guangdong 518055, China）

Abstract:The bacterial strain C-D6 which showed strong antifungal activity against Colletotrichum capsici was isolated from a rhizosphere soil sample. Based on morphological characteristics and analysis of 16s rDNA sequences and tetB-tetL gene specific sequences, strain C-D6 was identified as Bacillus subtilis. Strain C-D6 showed strong antagonistic activity against several pathogenic fungi, including C. capsici, Fusarium oxysporum, Cylindrocladium spathiphylli and Phytophthora nicotianae, on potato dextrose agar plate. Light microscopic observation showed that culture filtrate of strain C-D6 had a significant inhibitory effect on appressorium formation of C. capsici. These results suggest that B. subtilis C-D6 could be a potential bio agent for control of anthracnose caused by C. capsici.

Key words:bacillus subtilis; colletotrichum capsici; appressorium formation

*通訊作者：曾大興（1963-），男，教授，主要研究領域為真菌病害生物防治.E-mail:zengdx@szpt.edu.cn.

作者簡介：喇文軍（1977-），男，陜西人，實驗師，主要從事生物技術應用的教學與科研工作.

收稿日期：2015-11-16

DOI:10.13899/j.cnki.szptxb.2016.03.010

中圖分類號：S436.418

文獻標志碼：A

文章編號：1672-0318（2016）03-0048-05