RNASET2過表達對人前列腺癌細胞生物學行為的影響*

馬大驊姜夢迪管藝貝徐菲菲黃 楷劉 悅丁之德

上海交通大學醫學院解剖學與組織胚胎學系（上海 200025）

RNASET2過表達對人前列腺癌細胞生物學行為的影響*

馬大驊△姜夢迪△管藝貝△徐菲菲△黃 楷△劉 悅**丁之德**

上海交通大學醫學院解剖學與組織胚胎學系（上海 200025）

目的研究RNASET2在前列腺腫瘤內的表達情況及其過表達對人前列腺腫瘤細胞系DU145細胞生物學行為的影響。方法通過Western blot及免疫組化檢測RNASET2蛋白在人前列腺癌組織與癌旁組織中的表達情況；通過慢病毒轉染方法在DU145細胞中過表達RNASET2，以Quantitive realtime PCR、激光共聚焦顯微鏡檢測轉染效率；通過CCK-8方法檢測轉染后細胞活力；通過細胞劃痕實驗和transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲力；通過微絲染色檢測細胞骨架結構變化。結果（1）RNASET2在人前列腺腫瘤組織中表達明顯低于癌旁組織；（2）DU145細胞過表達RNASET2后，細胞活力顯著降低，細胞遷移及侵襲力下降，細胞形態和細胞微絲骨架顯著變化。結論RNASET2可能在前列腺癌的發生、發展中起重要作用，與肌動蛋白結合可能是其抑制腫瘤細胞侵襲的關鍵。

核糖核酸酶類; 前列腺腫瘤; 細胞運動; 腫瘤侵潤

核糖核酸酶（Ribonuclease，簡寫為RNase）是一類核酸水解酶，其中能利用2’,3’-環核苷酸將RNA水解為3’單核苷酸的一類核糖核苷酶，可根據分子質量分為兩組，RNase T1家族及RNase T2家族，前者分子量較小（11-12 kDa），后者分子質量較大（24-36kDa）[1]。RNase T2廣泛存在于自然界的微生物及動植物中，而RNASET2（又稱RNASE6PL、bA514O12.3）是一種存在于人體中的RNase T2酶，由7個α螺旋和8個β折疊組成具有Rh/T2/S糖蛋白家族典型的結構，也是人體內唯一一個該家族的胞外核酸酶。該蛋白在人體內由RNASET2基因編碼，即一個定位于6q27，全長約27kb含9個外顯子的單拷貝基因[2]，該基因同時也是Ⅱ類腫瘤抑制基因，在原發性卵巢腫瘤或細胞系、黑色素細胞瘤細胞系及非霍奇金淋巴瘤中RNASET2轉錄水平下調，提示該蛋白低表達可能促進多種實體瘤和血液腫瘤的形成[3-5]，另外，還有實驗證實 RNASET2沉默的卵巢癌細胞系注射裸鼠后會導致裸鼠體內腫瘤發生，且其抑腫瘤作用與蛋白的酶解作用無關[6]。ACTBIND是一種黑曲霉（Aspergillus niger B1）產生的胞外RNase T2，能與actin蛋白結合并干擾細胞骨架構建，而RNASET2是人體中該蛋白的同源體，提示RNASETS可能具有抑制癌癥細胞侵襲和抗腫瘤血管生成的作用[7]。

前列腺癌（prostatic cancer，PCa）是一種男性生殖系最常見的惡性腫瘤。隨著我國人口老齡化比例的升高，生活方式的改變，PCa在中國的發病率也在逐年上升[8]，據2014年中國腫瘤登記年報顯示，前列腺癌已升至中國男性泌尿腫瘤死亡率第一位，且該腫瘤的臨床治療效果亟待提高。因此，尋找一種臨床有效的治療前列腺腫瘤的新方法迫在眉睫。在前期研究中，我們發現RNASET2在前列腺癌旁正常組織中的表達顯著高于癌組織，但目前未有報道揭示RNASET2對前列腺腫瘤的抑制作用及其機制。我們應用前列腺癌細胞系DU145細胞，通過慢病毒轉染過表達RNASET2蛋白，檢測轉染后腫瘤細胞的細胞活力、細胞侵襲、細胞遷移率等癌細胞生物學行為參數的變化，進一步研究RNASET2對前列腺腫瘤發生及侵襲過程的影響。

材料與方法

一、實驗材料

人前列腺癌細胞系PC3、DU145（購自復旦IBS細胞資源中心）, 前列腺癌臨床病理組織和癌旁組織（上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院和復旦大學附屬華山醫院病理中心提供，各7例），人RNASET2過表達慢病毒（購自上海吉凱生物科技有限公司慢病毒表達文庫）。

二、主要試劑與儀器

（一）試劑

Trizol（Ambion），逆轉錄酶、SYBR Green PCR Master Mix（Takara），免疫組化試劑盒（Invitrogen），正常小鼠/兔IgG（Yeasen），小鼠抗RNase T2抗體（Santacruze），兔抗actin抗體（CST），HRP標記山羊抗兔/小鼠二抗（Jackson ImmunoResearch），鬼筆環肽羅丹明（Invitrogen），CCK-8細胞活力檢測試劑盒（Dojindo），RIPM 1640培養液（Hyclone），RIPA細胞裂解液（Pierce）。

（二）儀器

紫外/可見分光光度計（NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer），PTC-200 PCR 儀（MJ Research），激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss LSM-510）。

三、方法

（一）細胞培養和RNASET2過表達

人前列腺癌細胞DU145以RIPM1640培養液（含10%胎牛血清）培養。過表達實驗組在細胞密度達30%時進行慢病毒感染細胞（MOI=20），48h后用于實驗。

（二）蛋白免疫印跡（Western blot）實驗

前列腺癌臨床病理組織和癌旁組織（7例）在RIPA裂解液中以玻璃勻漿器研磨提取蛋白，測定蛋白濃度后分裝置于-80℃保存待用。

吸取上述組織蛋白各約30μg進行SDS-PAGE電泳，半干轉膜儀電轉移到PVDF膜上，隨后，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1h，實驗組加入小鼠抗RNASET2單克隆抗體（1:4000稀釋），對照組加入正常小鼠IgG（1:4000），4℃過夜，次日TBST洗膜3次后加入HRP標記的二抗（1:5000，羊抗鼠）室溫再孵育1 h，TBST洗膜后用ECL化學發光試劑盒顯色、成像。

（三）免疫組化檢測

前列腺癌組織和癌旁組織（7例）經4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片。組織切片脫臘，水化，洗滌。 3% H2O2孵育10 min。檸檬酸抗原修復液中，微波加熱抗原修復。免疫組化染色按試劑盒說明書操作。小鼠抗RNASET2多克隆抗體（1:200稀釋）為一抗。顯色后，以蘇木精襯染細胞核。常規脫水，透明，封片后鏡檢。

（四）熒光定量PCR檢測

運用PRIMER PREMIER 5.0軟件設計引物。上游引物5’-GCGGATCCCCCGATAAAAGTGAAG GA-3’，下游引物5’-GCAAGCTTAGGTGGGGGAT AGAAGAC-3’。目的片段長169bp。

細胞提取RNA，反轉錄為cDNA。采用SYBR Green染色法進行熒光定量PCR分析，檢測RNASET2基因表達情況, 反應條件如下：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 34s循環40次。通過測定Ct值表示目的基因mRNA的表達量，以2-△△Ct法（Livak法）顯示基因表達的相對變化分析實驗結果。

（五）細胞活力檢測

采用CCK-8細胞活力檢測試劑盒，每500μL細胞培養液中加入5μL CCK-8試劑，37℃，5% CO2培養箱中孵育60min，吸取200μL培養液置于96孔酶標板中，檢測A490吸光值，從而判斷細胞活力。

（六）細胞劃痕實驗

用記號筆在6孔板背后均勻劃橫線，每隔0.5~1cm一道，每孔至少穿過5條線。每孔中加入約5×105個細胞，可鋪滿過夜。次日用槍頭垂直于背后的橫線劃痕，PBS洗3次，加入無血清培養基，37℃5% CO2培養箱培養，24h后取樣，拍照。

（七）細胞遷移實驗（Transwell法）

將實驗組和對照組細胞分別消化、分離為各自的單細胞懸液，PBS洗滌細胞，以無血清RIPM1640培養基調整細胞濃度為1×104/mL。向Transwell小室每孔均加入100μL細胞懸液，并在室中加入500μL含有10%FBS完全培養基，37℃孵育12h后4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，洗滌后擦去上表面細胞，觀察拍照。

（八）細胞侵襲實驗（Transwell法）

對Transwell小室進行鋪膠處理：無血清培養基和Matrigel按3:1混合，加入小室，37℃孵育1~2h。

將實驗組和對照組細胞分別消化、分離為各自的單細胞懸液，PBS洗滌細胞，以無血清RIPM1640培養基調整細胞濃度為1×106/mL。每孔均加入100μL細胞懸液，并在室中加入500μL含有10%FBS完全培養基，37℃培養箱中孵育48h后4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，洗滌后擦去上表面細胞，觀察拍照。

（九）鬼筆環肽熒光素微絲染色

細胞經4%多聚甲醛固定30min，0.2%Triton破膜10min，鬼筆環肽（用PBS 1:200稀釋）室溫避光孵育1h，PBS洗3次，DAPI（1:1000）3min染色細胞核，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

（十）統計學分析

采用 SPSS 11.0統計軟件（Chicago，IL）進行數據處理，應用單因素方差分析對每組數據進行統計學分析。 P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、檢測前列腺癌組織與癌旁組織中RNASET2的表達

通過Western blot及免疫組化染色檢測前列腺癌旁正常組織和前列腺癌組織中的RNASET2蛋白表達（圖1A，圖1B）。結果均顯示：前列腺癌組RNASET2表達較癌旁組織明顯降低。

二、慢病毒轉染DU145后RNASET2的轉染效率與表達

六孔板培養細胞至密度達30%后，將包裝好的慢病毒轉染細胞通過共聚焦顯微鏡檢測GFP熒光信號觀察，可見視野中充滿轉染成功的表達綠色熒光的DU145細胞（圖2A）。

慢病毒轉染48h、72h后分別通過實時熒光PCR檢測RNASET2的表達。結果顯示：轉染48h后RNASET2的表達量為對照組的2倍以上，轉染72h后RNASET2的表達量為對照組的2.5倍左右（圖2B）。需要說明的是，由于過表達RNASET2后，細胞狀態不佳，部分細胞死亡。因此，雖然細胞轉染效率很高，但檢測到細胞中RNASET2過表達水平并不是特別高。

三、RNASET2過表達對DU145細胞活力的影響

通過CCK-8實驗檢測細胞活力，結果顯示：實驗組細胞活力（A450：1.3±0.2）相對于對照組細胞活力（A450：3.0±0.2）顯著下降（P＜0.01）（圖2C）。

四、RNASET2對前列腺癌細胞遷移及侵襲力的影響

（一）RNASET2對前列腺癌細胞遷移和侵襲力影響

RNASET2過表達的DU145細胞在劃痕實驗中遷移距離較對照組明顯減小[（746.44±39.04） μm vs（821.85±18.99）μm， P＜0.05]（圖3），在遷移實驗中穿過聚碳酸酯膜的細胞數也少于對照組[（217.60±60.02）個 vs（408.00±34.45）個，P＜0.05]（圖4），同時在侵襲實驗中穿過Matrigel膠和聚碳酸酯膜的細胞數較對照組也明顯減少（24.33±11.02 個vs 58.33±4.04個，P＜0.05）（圖4），表明RNASET2可明顯抑制前列腺癌細胞的遷移和侵襲力。

圖1 前列腺癌組織與癌旁組織中RNASET2的表達

圖2 慢病毒轉染后DU145細胞中RNASET2的表達及對細胞活力的影響

圖3 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移力

圖4 Transwell實驗檢測細胞遷移力和侵襲力

（二）RNASET2對前列腺癌細胞形態的影響

對DU145細胞進行RNASET2過表達（慢病毒轉染）處理，后利用鬼筆環肽熒光素進行微絲染色。結果顯示：相比對照組未處理細胞，RNASET2過表達處理后細胞形態有收縮變圓的趨勢，細胞內部微絲纖維結構消失，即過表達處理可能影響細胞運動能力（圖5）。

討 論

前列腺癌是一種男性生殖系統最常見的惡性腫瘤。多年來，針對該腫瘤的研究和實驗層出不窮。RNASET2基因廣泛存在于動植物及微生物細胞中，其編碼的蛋白是人體Rh/T2/S糖蛋白家族唯一的胞外核酸水解酶，在胞外pH為5時可催化多聚核苷酸的水解。該基因同時也是Ⅱ類腫瘤抑制基因，在裸鼠體內人為抑制RNASET2的表達會誘導卵巢癌的發生[6]，同時，有研究表明[9]，向培養液中加入RNASET2蛋白后，黑色素瘤細胞的遷移和侵襲受到抑制。然而，對前列腺腫瘤目前國內外還未見實驗揭示RNASET2對該腫瘤的發生、遷移和侵襲影響等腫瘤生物學行為的研究報道。

圖5 RNASET2過表達后對DU45細胞微絲的影響

在本實驗前期研究中我們發現，RNASET2在前列腺癌旁正常組織中表達顯著高于腫瘤組織，同時，相比正常細胞，RNASET2基因過表達的DU145細胞其活力明顯降低，提示該基因對前列腺腫瘤具有一定的抑制作用。

A C T I B I N D是一種從黑曲霉菌中提取的RNASET2，能與在體內和細胞表面的actin有效結合，共同形成一個氫鍵網絡[10]， 阻斷細胞的遷移。人RNASET2與ACTIBIND功能類似，Nesiel-Nuttman[11]等發現RNASET2蛋白的第135-141個殘基所形成的肽段對其與actin的結合具有重要意義。因此，RNASET2很可能通過同樣的方式影響前列腺腫瘤細胞的遷移和侵襲過程。

本項研究的劃痕實驗和Transwell實驗顯示，RNASET2過表達的DU145細胞其遷移和侵襲力均明顯降低，且用鬼筆環肽熒光素進行微絲染色后觀察到腫瘤細胞形態收縮變圓，細胞內部微絲纖維結構消失，提示前列腺癌細胞中過表達的RNASET2通過與肌動蛋白作用以抑制其侵襲和遷移過程。

總之，結合本實驗及RNASET2在大腸癌、卵巢癌、黑色素瘤等惡性腫瘤中的研究[3,6,12,13]可以發現，RNASET2在前列腺腫瘤治療如抑制癌癥進展、侵襲等方面有較為廣闊的應用前景。如一些RNASET2功能性小片段可以作為生物制劑進行應用，有研究發現trT2-50（只保留了結合actin功能的RNASET2片段）在抑制血管生成、克隆集落生成和腫瘤進展方面有較為顯著的效應[14]；另外，由于RNASET2作為一種分泌性糖蛋白，多項研究也表明在腫瘤微環境中其會發揮更為明顯的作用。因此，在后續的實驗中，我們將構建裸鼠動物人前列腺癌種植模型，進一步觀察RNASET2對于活體小鼠人前列腺移植瘤的影響，這也為今后臨床上研究前列腺癌發生、發展的病理機制以及前列腺癌診治新方法的探索提供重要的理論基礎和充分的實驗依據。

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（2016-09-08收稿）

The effects of RNASET2 over-expression on biological behaviors of human prostate cancer cells*

Ma Dahua△, Jiang Mengdi△, Guan Yibei△, Xu Feifei△, Huang Kai△, Liu Yue**, Ding Zhide**
1. Department of Anatomy, Histology and Embryology, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025, China

Liu Yue, E-mail: liuyue@shsmu.edu.cn; Ding Zhide, E-mail: zding@shsmu.edu.cn

ObjetiveTo analysis the expression of RNASET2 in prostate tumor cells and explore its effect on DU145 cell biological behaviours, including cell viability, migration and invasion.MethodsThe expressions of RNASET2 in human prostate cancer and peri-cancer tissue were measured by Western blot and immunohistochemistry. The fuorescence confocal microscopy and quantitive realtime PCR were used to test the expression level of RNASET2 in DU145 cell transfected by lentivirus. The effect of RNASET2 on post-transfection cell viability was analyzed by CCK-8, and tumor cell migration and invasion were detected by wound healing test and Transwell test individually. Finally, the cytoskeletal structure change was observed by staining of microflament.Results(1) The expression level of RNASET2 in human prostate cancer tissue was signifcantly lower than that in peri-cancer tissue. (2) Over-expressing RNASET2 in DU145 cell showed a signifcant decrease in cell viability, migration and invasion as well as morphological and cytoskeletal structure changes.ConclusionRNASET2 may play a vital role in the development of prostate cancer and actin-binding may be the key factor in its inhibitory effect on cancer cell migration and invasion.

Ribonucleases; prostatic neoplasms; cell Movement; neoplasm invasiveness

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.11.002

R 737.25

資助：上海交通大學醫學院第八期大學生創新項目（2014010）

**共同通訊作者：劉悅，E-mail: liuyue@shsmu.edu.cn；丁之德，E-mail: zding@shsmu.edu.cn

△為上海交通大學醫學院臨床醫學系12級八年制