GSK3β、CXCR4、MMP-2與胰腺癌侵襲和轉移的關系

許 瑩，潘振國，李倩君，潘 峰，吳 健

南京醫科大學附屬淮安第一醫院1.消化內科; 2.病理科， 江蘇 淮安 223300

GSK3β、CXCR4、MMP-2與胰腺癌侵襲和轉移的關系

許 瑩1，潘振國1，李倩君1，潘 峰1，吳 健2

南京醫科大學附屬淮安第一醫院1.消化內科; 2.病理科， 江蘇 淮安 223300

目的 研究GSK3β、CXCR4、MMP-2在人胰腺癌組織及癌旁組織中的表達，探索三者與胰腺癌轉移、侵襲的關系。方法 采用免疫組化法檢測人胰腺癌及癌旁組織標本中GSK3β、CXCR4、MMP-2的表達，采用Real-time PCR檢測胰腺癌癌組織及癌旁組織中GSK3β、CXCR4、MMP-2 mRNA的表達。結果 GSK3β、CXCR4、MMP-2在胰腺癌組織中的陽性表達均明顯高于癌旁組織(P<0.05)，胰腺癌患者癌組織中GSK3β、CXCR4、MMP-2 mRNA表達均明顯高于癌旁組織(P<0.05)。并且三者在癌組織陽性表達均與患者是否存在淋巴結轉移有相關性(P<0.05)。結論 GSK3β、CXCR4、MMP-2三者在胰腺癌組織中高表達，且都和胰腺癌患者淋巴結轉移有關。

胰腺癌；GSK3β；CXCR4；MMP-2

胰腺癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，起病隱匿、發展迅速、預后極差[1-2]，未經治療者1年生存率約20%，5年生存率不到4%。在我國，胰腺癌發病率呈逐步上升趨勢，已成為嚴重危害我國人口健康的惡性腫瘤。腫瘤的發生轉移是多基因引起的，因此深入研究和胰腺癌發生轉移有關的相關指標，可以為胰腺癌的治療提供新的理論依據。相關研究表明GSK3β、CXCR4、MMP-2與細胞增殖有關[3]，且在多種腫瘤組織內高表達，目前未有關于GSK3β、CXCR4、MMP-2三者在胰腺癌中的研究，因此我們推測三者在胰腺癌中可能高表達，可能與胰腺癌轉移有關。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集南京醫科大學附屬淮安第一醫院2011年-2014年手術切除并確診為胰腺癌的77例標本，其中男51例，女26例，年齡41歲～75歲，平均年齡(58±5)歲，胰腺癌的臨床分期按2002年國際抗癌聯盟制定的TNM分期法進行[4]，對照組為上述77例標本中15例癌組織邊界≥1 cm的癌旁組織。

1.2 主要試劑 GSK3β鼠抗人單克隆抗體及MMP-2 兔抗人單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)。兔抗人CXCR4 多克隆抗體購自Abcam公司、DAB 顯色試劑盒及 SP 免疫組化試劑盒(博士德生物工程有限公司)。Trizol﹑逆轉錄試劑盒﹑RNasin﹑SYBR Green(購自Invitrogen公司)，內參β-actin和目的基因引物由Invitrogen公司合成。

1.3 實驗步驟 免疫組化步驟：(1)組織標本常規脫蠟脫水。(2)阻斷滅活內源性過氧化物酶：3%過氧化氫孵育，PBS沖洗3次，5 min/次。(3)抗原修復，放入枸櫞酸緩沖液(pH<6.0)中煮沸(95 ℃)15～20 min，自然冷卻，PBS沖洗3次，5 min/次。(4)5% 正常山羊血清(PBS 稀釋)封閉，室溫孵育 10 min后滴加 一抗，4 ℃ 過夜。(5)PBS沖洗3次，每次5 min(用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照)，滴加生物素標記二抗孵育，PBS沖洗沖洗3次，每次5 min。(6)滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液孵育，PBS沖洗沖洗3次，每次5min。(7)DAB染色，自來水沖洗后，蘇木素復染，常規脫水，透明，干燥，封片。

Real-time PCR步驟：(1)GSK3β、CXCR4、MMP-2的陽性標本為手術切除的胰腺癌組織，對照組為癌組織邊界1 cm以上切除的癌旁組織。(2)Trizol法提取細胞的總RNA，在-80 ℃冰箱中取出癌組織及癌旁組織標本，每個標本加入Trizol后勻漿器勻漿后放入相應標號的EP管中，并標記好。(3)充分混勻后，每個EP管中加入氯仿后12 000 r/min,離心15 min。(4)小心的取出(3)中離心后的上層水相，放入新編號的EP管中，(不要全部將上層水相取出，寧少勿多)。(5)加入異丙醇至(4)中的EP管中，輕輕混勻，在-20 ℃冰箱中放置1 h。(6)離心10 min后，棄去上清液，緩慢地沿EP管壁加入預冷的75%乙醇，7 500 r/min,離心10 min，棄去上清，EP管倒置放干燥,然后用無菌ddH2O溶解。(7)逆轉錄及Real-time PCR 反應檢測NS和18 sRNA的表達，按照逆轉錄試劑盒的說明步驟進行逆轉錄，逆轉錄完畢后上機進行目的基因和內參β-actin的擴增反應。

1.4 結果判定[5]根據陽性細胞百分比及染色強度進行綜合評分并做半定量分析，著色強度積分：所計數細胞無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，每張切片隨機取10個高倍視野，然后將10個視野的積分之和除以10，結果以四舍五入取整數作為細胞染色強度積分，然后再對每張切片的染色細胞數進行積分，每個視野按白細胞計數法計數100個細胞，陽性細胞所占百分比：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分，兩項評分相加，以0～1分作為切片陰性(-)，≥2分為陽性(+)，3～4分為中等陽性(++)，5～6分為強陽性(+++)。

1.5 統計學處理 采用 SPSS 19.0 進行統計學分析，以χ2檢驗進行定性資料的分析，以t檢驗進行配對資料的分析，相關性分析采用 Spearman, srhotest 進行分析。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 癌組織及癌旁組織GSK3β、CXCR4、MMP-2 mRNA表達 胰腺癌患者癌組織GSK3β、CXCR4、MMP-2 mRNA的表達明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 癌組織及癌旁組織GSK3β、CXCR4、MMP-2 mRNA表達圖

Fig 1 Expression of GSK3β、CXCR4、MMP-2 mRNA in pancreatic cancer and adjacent to cancer tissue

2.2 GSK3β、CXCR4、MMP-2與胰腺癌侵襲和轉移的關系 GSK3β在細胞質表達，陽性染色為細胞質中出現棕色或棕黃色顆粒(見圖2)，CXCR4的陽性細胞為包漿或包膜著色，染色為棕黃色，在胰腺導管及腺泡中均有表達，在間質組織中無表達(見圖3)；MMP-2主要在胞漿中表達。GSK3β、CXCR4、MMP-2在胰腺癌組織中的陽性表達明顯高于癌旁組織(P<0. 05，見表1)。GSK3β、CXCR4、MMP-2陽性表達在胰腺癌患者、是否有淋巴結轉移差異有統計學意義(P<0.05，見表 1)，而在性別及年齡方面差異無統計學意義P>0.05，見表1)。

圖2 GSK3β的表達情況(SP 100×); 圖3 CXCR4的表達情況(SP 100×); 圖4 MMP-2的表達情況(SP 100 ×) A:胰腺癌組織；B：癌旁組織

Fig 2 The expression of GSK3β(SP 100×); Fig 3 The expression of CXCR4(SP 100×); Fig 4 The expression of MMP-2(SP 100×) A: pancreatic cancer, B: adjacent to cancer tissue

表1 胰腺癌患者GSK3β、CXCR4、MMP-2的表達與臨床特征的關系

Tab 1 Relationship between the expression of GSK3β，CXCR4，MMP-2 and clinical features in pancreatic cancer

GSK3β+++/++/+-P值CXCR4+++/++/+-P值MMP?2+++/++/+-P值是否有淋巴結轉移 有轉移428<0．05307<0．054014<0．05 無轉移141324161112性別 男2811>0．053210>0．053018>0．05 女38102213218年齡(歲) >503812>0．053014>0．053717>0．05 <50189249149組別 癌組織509<0．05379<0．05407<0．05 癌旁組織61217141119

2.3 采用 Spearman, srhotest方法檢測GSK3β、CXCR4、MMP-2三者之間的相關性分析 GSK3β陽性表達與CXCR4 陽性表達呈正相關(r=0.140，P<0.05，見表2)，GSK3β陽性表達與MMP-2陽性表達正相關(r=0.144，P<0.05，見表3)，CXCR4陽性表達與MMP-2陽性表達正相關(r=0.156，P<0.05，見表4)。

表2 GSK3β表達與CXCR4表達的相關性

Tab 2 The correlation between expressions of GSK3β and CXCR4

CXCR4+++/++/+CXCR4-r值P值GSK3β+++/++/+46100．429<0．05GSK3β-813

表3 GSK3β表達與MMP-2表達的相關性

Tab 3 The correlation between expressions of GSK3β and MMP-2

MMP?2+++/++/+MMP?2-r值P值GSK3β+++/++/+41150．249<0．05GSK3β-1011

表4 CXCR4表達與MMP-2表達的相關性

Tab 4 The expression correlation of CXCR4 and MMP-2

MMP?2+++/++/+MMP?2-r值P值CXCR4+++/++/+42120．374<0．05CXCR4-914

3 討論

胰腺癌是目前威脅人類健康的惡性腫瘤之一，目前發病率呈上升趨勢，胰腺癌起病隱匿，早期臨床表現缺乏特異性，且病情發展較迅速，死亡率較高[1]，病死率已居于惡性腫瘤的第4位[2]，大多數患者確診胰腺癌已屬于晚期，及早的發現診治對胰腺癌患者尤為重要，但由于目前缺乏相對有效地治療方案[6]，積極的探尋胰腺癌發展及轉移的機制較重要。

GSK3β是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，它可以調節多種腫瘤細胞的糖代謝、細胞增殖與凋亡[7-8]，通過抑制GSK3β的表達，細胞可以發生EMT[9-10]，而EMT與腫瘤的發生發展有一定關系，研究發現GSK3β與腫瘤的侵襲及發展有一定的關系，本研究與發現胰腺癌癌組織GSK3β表達明顯高于癌旁組織，這與以往的研究相符合。趨化因子(chemokine)是一個細胞因子超家族，它在多種生理或病理過程中發揮重要作用。目前已發現多種趨化因子和受體[11]，CXCR4 是其中一個受體，目前發現多種腫瘤如肝癌表達CXCR4，并且發現CXCR4的表達量與腫瘤患者的預后有明確的關系[11-13]，相關研究也表明趨化因子與其受體CXCR4的相互作用和腫瘤的轉移進展有相關性[14-16]，MMP-2被認為能夠溶解細胞外基質，從而促進了腫瘤細胞的轉移。MMP-2它可以降解Ⅳ型膠原蛋白，在多種腫瘤組織中高表達，且與腫瘤的遠處轉移有一定的關系[17-18]。

GSK3β、CXCR4、MMP-2三者已經被證實與細胞的增殖有關，且在多種腫瘤組織內表達[3]，但目前暫未有在胰腺癌患者組織標本表達情況的相關研究，本研究顯示GSK3β、CXCR4、MMP-2三者的表達均明顯高于癌旁組織，且三者的的陽性表達與患者的性別、年齡無顯著性差異，但均與腫瘤患者是否淋巴轉移有明顯的相關性，認為GSK3β、CXCR4、MMP-2三者的含量高低與胰腺癌是否遠處轉移有一定的關系，這與以前其他腫瘤的相關研究[19]相吻合，進一步我們采用Spearman方法進行相關性分析后發現，GSK3β、CXCR4、MMP-2三者之間均存在正相關，我們推測可能存在GSK3β、CXCR4、MMP-2三者的信號通路，進而影響胰腺癌遠處轉移，我們下一步試驗將就三者之間的信號通路方面進行研究，以期胰腺癌的轉移機制提供更多的理論基礎。

[1]Goldstein D, Carrol S, Apte M, et al. Modern management of pancreatic carcinoma [J]. Intern Med J, 2004, 34(8): 475-481.

[2]Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. Cancer ststistics. 2009 [J]. CA Cancer J Clin, 2009, 59(4): 225-249.

[3]Mishra R. Glycogen synthase kinase 3 beta: can it be a target for oral cancer [J]. Mol Cancer, 2010, 9: 144.

[4]Bilim V, Ougolkov A, Yuuki K, et al. Glycogen synthase kinase-3: a new therapeutic target in renal cell carcinoma [J]. Br J Cancer, 2009, 101(12): 2005-2014.

[5]Mai W, Kawakami K, Shakoori A, et al. Deregulated GSK3{beta} sustains gastrointestinal cancer cells survival by modulating human telomerase reverse transcriptase and telomerase [J]. Clin Cancer Res, 2009, 15(22): 6810-6819.

[6]Paulson AS, Tran Cao HS, Tempero MA, et al. Therapeutic advances in pancreatic cancer [J]. Gastroenterology, 2013, 144(6): 1316-1326.

[7]Zhou F, Zhang L, Laar T, et al. GSK313 inactivation induces apoptosis of leukemia cells by repressing the function of c-Myb [J]. Mol Biol Cell, 2011, 22(9): 3533-3540．

[8]Zheng H, Saito H, Masuda S, et al. Phosphorylated GSK3β and EGFR are good prognostic factors for lung carcinomas [J]. Anticancer Res, 2007, 27(5): 3561-3569.

[9]Margariti A, Zampetaki A, Xiao Q, et al. Histone deacetylase controls endothelial cell growth through modulation of beta-cateni [J]. Circ Res, 2010, 106(7): 1202-1211.

[10]Farago M, Dominguez I, Landesman-Bollag E, et al. Kinaseinactive glycogen synthase kinase 3beta promotes Wnt signaling and mammary tumorigenesis [J]. Cancer Res, 2005, 65(13): 5792-5801.

[11]Balkwill F. Cancer and the chemokine network [J]. Nat Rev Cancer, 2004, 4(7): 540-550.

[12]Kajiyama H, Shibata K, Terauchi M, et al. Involvement of SDF-l alpha/CXCR4 axis the enhancedperitoneal metastasis of epithelial ovarian carcinoma [J]. Cancer, 2008, 12(1): 91-99.

[13]Tan CT, Chu CY, Lu YC, et al. CXCLl2/CXCR4 promotes laryngeal and hypopharyngeal squamous cell carcinoma metastasis through MMP-13-dependent invasion via the ERK1/2/AP-1pathway [J]. Carcinogenesis, 2008, 29(8): 1519-1527．

[14]Wang Z, Ma Q, Liu Q, et al. Blockade of SDF-1/CXCR4 signalling inhibits pancreatic cancer progression in vitro via inactivation of canonical Wnt pathway [J]. Br J Cancer, 2008, 99(10): 1695-1703.

[15]Su LP, Zhang JP, Xu HB, et al. The role of CXCR4 in lung cancer metastasis and its possible mechanism [J]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 2005, 85(17): 1190-1194.

[16]Burger M, Glodek A, Hartmann T, et al. Functional expression of CXCR4 (CD184) on small-cell lung cancer cells mediates migration, integrin activation, and adhesion to stromal cells [J]. Oncogene, 2003, 22(50): 8093-8101.

[17]Kamel H, Abdelazim I, Habib SM, et al. Immunoexpmsslon of matrix metallopmteinase-2(MMP-2)in malignant ovarian epithelial tumours [J]. J Obstet Gynaecol Can, 2010, 32(6): 580-586．

[18]Vijayababu MR, Arunkumar A, Kanagaraj P, et al. Quercetin down-regulates matrix metanopmteinases 2 and 9 proteins expression in prostate cancer cells [J]. Mol Cell Biochem, 2006, 287(2): 109-116.

[19]Durlik M, Gardian K. Metalloproteinase 2 and 9 activity in the development of pancreatic cancer [J]. Pol Przegl Chir, 2012, 84(8): 377-382.

(責任編輯：李健)

Relationship of invasion and metastasis of pancreatic cancer with GSK3β, CXCR4 and MMP-2

XU Ying1, PAN Zhenguo1, LI Qianjun1, PAN Feng1, WU Jian2

1.Department of Gastroenterology; 2.Department of Pathology, Huai’an First People’s Hospital, Nanjing Medical University, Huai’an 223300, China

Objective To investigate the expressions of GSK3β, CXCR4 and MMP-2 of pancreatic cancer and adjacent to cancer tissue, and explore the relationship of GSK3β, CXCR4, MMP-2 with invasion and metastasis of pancreatic cancer.Methods The expressions of GSK3β, CXCR4 and MMP-2 of pancreatic cancer and adjacent to cancer tissue were detected by immunohistochemistry techonology. The mRNA expressions of the three genes of pancreatic cancer and adjacent to cancer tissue were detected by Real-time PCR.Results The expressions of GSK3β, CXCR4 and MMP-2 in pancreatic cancer tissue were significantly higher than those in adjacent to cancer tissue both in gene and protein (P< 0.05), and they were significantly related with lymph node metastasis and clinical stage (P<0.05).Conclusion The expressions of GSK3β, CXCR4 and MMP-2 in pancreatic cancer tissue are high, and they have a relattionship with lymph node metastasis.

Pancreatic cancer; GSK3β; CXCR4; MMP-2

許瑩，主治醫師，碩士研究生，研究方向：胰腺癌的轉移機制。E-mail: xinying1318@163.com。

潘峰，主任醫師，醫學博士，碩士研究生導師，研究方向：胰腺癌的轉移機制。E-mail: fengliupan@126.com。

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.11.027

R735.9

A

1006-5709(2016)11-1308-04

2016-01-18