腸屏障功能障礙及cingulin、claudin-2表達變化在潰瘍性結(jié)腸炎中的作用

陳思羽，黃會云，陳 玉，平 倩，張 濤

1. 廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西 南寧 530011； 2. 廣西中醫(yī)藥大學

論著·潰瘍性結(jié)腸炎

腸屏障功能障礙及cingulin、claudin-2表達變化在潰瘍性結(jié)腸炎中的作用

陳思羽1，黃會云1，陳 玉2，平 倩2，張 濤1

1. 廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西 南寧 530011； 2. 廣西中醫(yī)藥大學

目的 通過檢測潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)結(jié)腸黏膜組織形態(tài)學、超微結(jié)構(gòu)變化及結(jié)腸黏膜扣帶蛋白(cingulin)、claudin-2表達，探討UC發(fā)病的可能機制。方法 40只清潔級雄性Balb-c小鼠隨機分為2組，其中正常組10只，模型組30只。除正常組外，模型組采用自由應用DSS法制備UC模型，于第8周末處死全部小鼠。應用光鏡及透射電鏡觀察結(jié)腸黏膜組織形態(tài)學、超微結(jié)構(gòu)及上皮黏膜屏障變化；應用AB-PAS及HID-AB染色觀察結(jié)腸黏蛋白變化；應用Real-time PCR技術(shù)檢測結(jié)腸黏膜cingulin、claudin-2表達。結(jié)果 模型組光鏡下見結(jié)腸黏膜不同程度缺損、潰瘍形成，表面可見壞死組織及隱窩膿腫形成；電鏡下見腸上皮細胞表面微絨毛稀疏，細胞連接間隙增寬，杯狀細胞減少，線粒體腫脹，結(jié)構(gòu)不清或呈空泡樣變，部分可見核固縮，并見凋亡小體。模型組結(jié)腸黏蛋白表達明顯較正常組減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模型組cingulin、claudin-2表達分別為2.32±0.47、2.41±0.65，與正常組比較，其表達呈下降趨勢，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論 cingulin通過促進claudin-2表達上升，破壞腸黏膜屏障完整，增加腸黏膜通透性導致結(jié)腸黏膜免疫反應異常，可能在UC發(fā)病中占據(jù)重要地位。

扣帶蛋白；Claudin-2；緊密連接；腸黏膜屏障；潰瘍性結(jié)腸炎

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是指基因易患基礎(chǔ)下，腸道細菌和環(huán)境因素共作用下，腸道黏膜免疫應答異常，破壞腸黏膜屏障完整，導致靶器官腸黏膜損傷、甚至潰瘍[1]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)UC同時存在結(jié)腸黏膜上皮細胞凋亡加速和炎性細胞凋亡延緩的病理特點，其中腸黏膜屏障完整性對于維持機體健康、防止組織損傷至關(guān)重要，而腸黏膜機械屏障是維持腸黏膜完整性的關(guān)鍵因素[2-3]。顯然，促進腸黏膜修復，維持腸黏膜屏障完整已是UC治療的新靶點和新目標。最近研究發(fā)現(xiàn)，反應性氧活性物質(zhì)(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生增加，釋放大量炎性介質(zhì)，破壞腸道緊密連接是腸道炎癥反應鏈的第一步，那么在ROS刺激作用下腸道緊密連接蛋白claudin家族、ZO-1蛋白是如何發(fā)生變化的呢[4]？扣帶蛋白(cingulin)在調(diào)控claudin-2、claudin-6表達參與維持腸黏膜屏障性中的作用與UC發(fā)病是否存在關(guān)聯(lián)[5]？本課題擬應用自由飲用DSS法制備UC模型，通過觀察cingulin、claudin-2、結(jié)腸黏膜超微結(jié)構(gòu)及結(jié)腸黏蛋白表達變化，探討其在UC發(fā)病中的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物Balb-c小鼠40只，SPF級雄性，5周齡，體質(zhì)量(18±2)g，購自湖南斯萊克景達實驗動物中心，動物許可證號SCXK(湘)2011-0003，動物合格證號：4304701479。其中正常組10只，模型組30只。

1.2 主要試劑葡聚糖硫酸鈉(DSS，貨號D8902)購自美國Sigma公司，2.5%戊二醛、中性甲醛、無水乙醇等均由廣州科宏生物技術(shù)公司提供，總RNA提取試劑盒、引物合成均由廣州藍吉生物技術(shù)公司完成。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA酶抑制劑由上海玉森生物技術(shù)公司提供。

1.3 主要儀器倒置相差顯微鏡(德國蔡司)、日本日立H-600透射電鏡、BIO-RAD-全自動酶標儀、ABI7500熒光PCR儀、5810R-高速低溫離心機等均由廣州藍吉生物技術(shù)公司提供。

1.4 方法

1.4.1 造模方法：參照文獻[6]報道，所有小鼠適應性喂養(yǎng)1周，正常組繼續(xù)適應性喂養(yǎng)，模型組小鼠均采用5% DSS自由飲用法連續(xù)喂養(yǎng)6周，繼而給予正常飲水，于第8周末處死全部小鼠(期間模型組小鼠死亡4只，解剖證實腸脹氣穿孔死亡)。詳細記錄小鼠耗食量、大便性狀等變化。

1.4.2 標本采集：全部小鼠于第8周末脫椎處死，截取從回盲部到直腸的全部腸段，在放大鏡下觀察結(jié)腸黏膜組織損傷情況，選取潰瘍或糜爛最明確處，沿縱軸切開，置于10%中性甲醛中待測，剩余部分置于超低溫冰箱中備用。

1.5 指標檢測

1.5.1 UC小鼠結(jié)腸黏膜病理學改變：將已用甲醛固定好的小鼠結(jié)腸取出，然后切取病變處，經(jīng)蒸餾水沖洗后逐級脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色，封片，光鏡下觀察病理情況。

1.5.2 UC小鼠結(jié)腸黏膜超微結(jié)構(gòu)及上皮屏障變化：電鏡固定液固定新鮮結(jié)腸組織，常規(guī)包埋、鈾染、超薄切片、H-600透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)變化及腸上皮屏障變化。

1.5.3 UC小鼠結(jié)腸黏膜黏蛋白表達變化：采用特殊染色即奧辛蘭-過碘酸-雪夫氏(AB-PAS)和高鐵雙胺-奧辛蘭(HID-AB)，嚴格按實驗步驟進行，應用Image Pro-plus 5.0軟件分析結(jié)腸黏蛋白表達變化。

1.5.4 UC小鼠結(jié)腸cingulin、claudin-2表達變化：應用實時熒光定量PCR法(Real-time PCR)，以GADPH為內(nèi)參，檢測cingulin、claudin-2 mRNA表達，具體步驟嚴格按照試劑說明書進行操作，以目的基因與GAPDH mRNA比值，作為目的基因的相對表達量。cingulin、claudin-2、GADPH引物序列見表1。

表1 cingulin、claudin-2、GADPH引物序列

注：在Gen Bank上查找目的基因mRNA序列，在CDS區(qū)設(shè)計特異性引物。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況變化正常組小鼠呈自然增長，無死亡現(xiàn)象；模型組小鼠造模期間分別于第2周、第4周各死亡2只，自第2周起出現(xiàn)大便帶黏液、血便，糞質(zhì)偏稀，耗食量較正常組下降，但未能詳細記錄并統(tǒng)計分析。

2.2 各組小鼠結(jié)腸黏膜組織病理學變化正常組：小鼠結(jié)腸黏膜完整，腺體排列整齊，個別可見少許炎性細胞浸潤；模型組：結(jié)腸黏膜不同程度缺損，表面滲出及壞死組織，潰瘍未累及黏膜肌層，并見隱窩結(jié)構(gòu)扭曲、隱窩膿腫形成，大量炎性細胞浸潤及黏膜下層充血腫脹(見圖1)。

2.3 各組小鼠結(jié)腸黏膜超微結(jié)構(gòu)及上皮屏障變化正常組：腸上皮屏障完整，微絨毛形態(tài)規(guī)則、排列整齊，較多杯狀細胞，線粒體豐富，嵴結(jié)構(gòu)清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未見改變，未見上皮細胞凋亡小體；模型組：腸上皮細胞表面微絨毛稀疏，長短不一，形態(tài)不規(guī)則，細胞連接間隙增寬，杯狀細胞減少，胞漿內(nèi)有空泡，線粒體腫脹，結(jié)構(gòu)不清，部分嵴消失，個別內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，或呈空泡樣改變，部分可見核固縮，并見凋亡小體(見圖2)。

圖2 小鼠結(jié)腸黏膜超微結(jié)構(gòu)及上皮屏障變化(10 000×) A：正常組；B：模型組

2.4 各組小鼠結(jié)腸黏蛋白表達變化模型組結(jié)腸黏蛋白表達較正常組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖3)。

2.5 各組小鼠cingulin、claudin-2表達變化模型組cingulin、claudin-2表達上調(diào)，與正常組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

圖3 小鼠結(jié)腸黏蛋白表達(100×) A：正常組(AB-PAS染色)；B：模型組(AB-PAS染色)；C：正常組(HID-AB染色)；D：模型組(HID-AB染色)

表2 小鼠結(jié)腸cingulin、claudin-2表達

注：與模型組比較，*P<0.05。

3 討論

前期我們研究發(fā)現(xiàn)，UC存在腸上皮細胞凋亡加速，腸黏膜屏障破壞的病理學特點[7]，但是腸上皮細胞凋亡加速的原因是否與上皮細胞脫落離開細胞外基質(zhì)，失去黏附環(huán)境所致失巢凋亡相關(guān)？或是腸黏膜屏障破壞尤其是調(diào)控緊密連接蛋白表達異常，造成食物抗原不停刺激腸上皮細胞導致凋亡加速有關(guān)[8-9]？腸黏膜屏障包括機械屏障、化學屏障、免疫屏障及生物學屏障，其中最為重要的是機械屏障。腸黏膜機械屏障主要是由上皮緊密連接而實現(xiàn)的，腸上皮細胞緊密連接是一種選擇性屏障，其功能完整依賴于健康的上皮細胞核正常功能的細胞旁路的存在。生理情況下，腸上皮細胞通過不斷更新、增殖維持腸道功能完整，而維持該功能完整必不可缺少的主要結(jié)構(gòu)之一是細胞骨架。細胞骨架是細胞內(nèi)一種復雜的絲狀蛋白結(jié)構(gòu)，遍布于細胞漿內(nèi)，是維持腸道上皮細胞的正常結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)運和功能完整性不可或缺的，因此細胞骨架是維持腸黏膜屏障功能的一個關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，它包括三種蛋白絲：肌動蛋白、微管和中間絲[10]。扣帶蛋白(cingulin/CGN)是分子量為140 KDa的蛋白，位于緊密連接的細胞質(zhì)區(qū)域，通過與多種緊密連接蛋白包括ZO-1、ZO-2、ZO-3及肌動蛋白、肌球蛋白結(jié)合可能是維持緊密連接完整的重要機制之一[11]。研究表明，cingulin通過RhoA信號刺激，調(diào)控緊密蛋白如claudin-2、claudin-6、claudin-7及occulidin表達，而cingulin基因沉默后，明顯導致上述蛋白表達下降[12]。本課題發(fā)現(xiàn)，UC小鼠結(jié)腸cingulin蛋白表達上升，且該表達與UC結(jié)腸黏膜組織損傷呈正相關(guān)。

UC患者腸道黏膜上皮中，緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)和功能也在發(fā)生改變，緊密連接蛋白廣泛分布于上皮、內(nèi)皮、間皮細胞膜上，在細胞間組成分子屏障調(diào)節(jié)分子和離子在細胞間隙的彌散[13]。同時還能夠有效分隔細胞頂端和細胞其他部分，從而防止膜蛋白相互混合。另外，它們在細胞極性形成及細胞黏附方面同樣發(fā)揮重要作用。緊密連接蛋白構(gòu)成的分子屏障是固有免疫的主要組成部分，能夠有效地阻止病原微生物透過上皮細胞層引起疾病[14]。研究表明，緊密連接蛋白參與細胞的分化和增殖，在組織損傷修復及細胞再生方面發(fā)揮重要作用[15]。研究表明，claudin-2蛋白在腸黏膜屏障功能維持中起重要作用，并輔助形成電子選擇通道輔助鈣離子經(jīng)細胞旁轉(zhuǎn)運[16]。我們發(fā)現(xiàn)，UC小鼠孔道形成,蛋白claudin-2表達升高，同時隨著上皮細胞凋亡的升高，導致上皮細胞損傷，并可能增強細胞旁途徑的滲透能力，加重腸黏膜損傷。

本課題研究結(jié)果提示UC小鼠存在黏蛋白表達減少，腸上皮細胞緊密連接間隙增寬，上皮細胞凋亡明顯較正常組增多，并伴cingulin調(diào)控腸道緊密連接蛋白中孔道蛋白claudin-2表達上升。我們推測cingulin蛋白表達增加，導致孔道形成，claudin-2表達呈上升趨勢，由此可能促使腸黏膜通透性增加，大量食物抗原逸入、腸道菌群移位，結(jié)腸黏膜免疫失常，導致腸黏膜受損、潰瘍。因此，以調(diào)控cingulin、claudin-2蛋白為著眼點，促進腸黏膜屏障修復及其功能完整，將有望為UC防治提供新的靶點。

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(責任編輯：馬 軍)

Effect of the intestinal barrier dysfunction and the changes of cingulin and claudin-2 in ulcerative colitis

CHEN Siyu1, HUANG Huiyun1, CHEN Yu2, PING Qian2, ZHANG Tao1

1. Department of Gastroenterology, the Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of TCM, Nanning 530011; 2. Guangxi University of TCM, China

Objective To investigate the mechanism of ulcerative colitis (UC) via the observation of colon mucosa morphological and ultrastructural and the expressions of cingulin, claudin-2. Methods Forty Balb-c rats were randomly divided into normal group and model group. Except normal group, the model group was administrated by drinking 5% DSS for the preparation of UC model. All rats were sacarificed after eighth weeks. The mucosa tissue morphology, colonic ultrastructure and the epithelial mucosa barrier were detected by the light microscope and electron microscope respectively. The changes of colonic mucin were detected by AB-PAS and HID-AB staining. The expressions of cingulin and claudin-2 in the colonic mucosa were detected by Real-time PCR. Results There were different degrees of defected colonic mucosa, ulceration and crypt abscess with necrotic tissue on surface under light microscope in model group. Also there were microvilli sparse on the intestinal epithelial cell, the intercellular spaces, the decreased goblet cells, the swelling mitochondria, the unclear structure with vacuolar degeneration, the pyknosis nuclear and apoptotic bodies under electron microscope. The expressions of colonic mucin secretion in model group was significantly higher than taht in the normal group (P<0.05). The expressions of cingulin and claudin-2 in model group were 1.03±0.39 and 1.12±0.26 respectively and there was a statistical difference compared with normal group (P<0.05). Conclusion Cingulin plays an important role in the control of claudin-2 expression and response to the onset of UC.

Cingulin; Claudin-2; Tight junction; Intestinal mucosa barrier; Ulcerative colitis

國家自然基金(81260536)；廣西自然基金(2013GNSFAA019116)

陳思羽，主治醫(yī)師，研究方向：消化系疾病基礎(chǔ)與臨床。E-mail：11589351@qq.com

張濤，副研究員，博士，研究方向：炎癥性腸病中西醫(yī)結(jié)合防治。E-mail：327664246@qq.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.01.010

R574.62

A

1006-5709(2016)01-0043-04

2015-03-26