艾灸對潰瘍性結腸炎大鼠結腸TLR4和TNF-α蛋白及其mRNA表達影響的研究＊

王曉梅，黃 艷，王圓圓，劉雅楠，祁 琴，金 鳳，華雪桂，吳煥淦＊＊

（1.上海市針灸經絡研究所 上海 200030；2.上海中醫藥大學 上海 201203；3.復旦大學附屬腫瘤醫院 上海 200032）

艾灸對潰瘍性結腸炎大鼠結腸TLR4和TNF-α蛋白及其mRNA表達影響的研究＊

王曉梅1，黃 艷1，王圓圓2，劉雅楠2，祁 琴2，金 鳳3，華雪桂1，吳煥淦1＊＊

（1.上海市針灸經絡研究所 上海 200030；2.上海中醫藥大學 上海 201203；3.復旦大學附屬腫瘤醫院 上海 200032）

目的：觀察艾灸對潰瘍性結腸炎大鼠結腸Toll樣受體4（TLR4）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）蛋白及其mRNA表達的影響，進一步探討艾灸治療潰瘍性結腸炎的作用機制。方法：將40只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、隔藥灸組和柳氮磺胺吡啶（Sulfasalazine，SASP）組。采用隔藥灸天樞和氣海穴及SASP灌胃進行干預。干預結束后，應用HE染色光鏡下觀察各組大鼠結腸病理學變化，分別采用Western blot法和FQ-PCR法檢測大鼠結腸TLR4和TNF-α蛋白及其mRNA表達。結果：造模大鼠存在結腸組織病理學損傷，隔藥灸組和SASP組大鼠結腸病理學與模型組相比均有一定的改善；與正常組比較，模型組大鼠結腸TLR4和TNF-α蛋白及其mRNA表達均顯著增加（P＜0.05）；經隔藥灸和SASP干預后，大鼠結腸TLR4和TNF-α蛋白及其mRNA表達均顯著降低（P＜0.05）。結論：TLR4、TNF-α可能在潰瘍性結腸炎中發揮炎癥損傷作用，隔藥灸能下調潰瘍性結腸炎大鼠結腸TLR4和TNF-α的表達，提示其機制可能是通過下調 TLR4和TNF-α表達介導的級聯反應達到艾灸治療潰瘍性結腸炎的目的。

艾灸 潰瘍性結腸炎 Toll樣受體4 腫瘤壞死因子α

潰瘍性結腸炎（Ulcerative Colitis，UC）和克羅恩?。–rohn’s Disease，CD）統稱炎癥性腸病，是一種病因不明的慢性直腸和結腸炎癥性疾病，臨床以腹痛、腹瀉、黏液或膿血便為特征，病變主要限于黏膜層和黏膜下層。UC在歐美發達國家發病率較高，近期的研究表明，西歐IBD的發病率是東歐的2倍[1]，美國婦女UC的發病率為10/10萬[2]，美國兒童UC的發病率也不斷升高[3]，匈牙利人UC的發病率為11.9/10萬[4]。近年來，澳大利亞UC發病率為23.67/10萬，亞洲國家UC發病率逐年增加，中國UC的發病率約為3.44/10萬[5]。

Toll樣受體-4（Toll-like Receptors-4，TLRs-4）是固有免疫系統中的細胞跨膜受體及病原模式識別受體之一，它主要通過識別病原相關分子模式來啟動免疫反應。已發現TLRs在炎癥、細胞信號轉導、細胞凋亡、腫瘤等發生過程中扮演重要角色[6]，在腸黏膜免疫中發揮重要作用[7]。TLRs家族包括10個成員，其中TLR4在IBD發病中發揮重要角色，在CD和UC結腸組織中均有表達[8-10]，TLR4可通過核因子κB信號通路誘導腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）等炎癥介質的表達[11]。

前期研究表明，隔藥灸對UC患者有良好的療效，不僅有效改善UC患者結腸異常的免疫反應[12]，下調UC患者結腸黏膜IL-8和ICAM-1蛋白和基因的表達[13]，還可以調節UC模型大鼠結腸TLR2[14]及TLRs信號傳導通路下游因子KGF、TNF-α、IL-12和IL-6表達[15，16]。本研究采用免疫學方法并加局部刺激制備UC大鼠模型[17]，并利用Western blot法及FQ-PCR法，觀察UC大鼠結腸組織的TLR4和TNF-α蛋白及其mRNA表達水平，探討TLRs在UC發病過程中的作用，揭示艾灸治療UC的關鍵信號分子和作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級Sprauge-Dawley（SD）雄性大鼠40只，體質量183±10 g，由復旦大學醫學院動物實驗中心提供。實驗動物在實驗前適應性飼養3天，飲食、飲水、精神狀況正常者納入實驗。

1.2 分組與模型制備

將40只大鼠隨機分正常組、模型組、隔藥灸組和柳氮磺胺吡啶（Sulfasalazine，SASP）組，每組10只。

除正常組外其余3組采用免疫學方法合并局部刺激制備UC大鼠模型[17]。將UC患者術后新鮮結腸黏膜，加適量生理鹽水制成黏膜勻漿，冷凍24 h溶解后，以3 000 r·min-1離心30 min，取上清液提純測定蛋白質含量，并與完全弗氏佐劑混勻配成乳劑。造模大鼠首次于足趾內注射抗原液0.3 mL（蛋白含量6 mg），并分別于第10、17、24、31天，于足趾、背部、腹股溝、腹腔內注射抗原0.3 mL（蛋白含量6 mg，末次注射不加完全弗氏佐劑）；至第38天，造模大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，3%甲醛2 mL灌腸，留置1 h，用生理鹽水灌腸沖洗，再用含24 mg·mL-1蛋白的抗原液灌腸，留置2 h，用生理鹽水再灌腸沖洗。正常組SD大鼠注射生理鹽水，處理步驟與造模組相同。

造模結束后，分別取正常組2只和造模大鼠組1只進行模型鑒定，組織病理學結果提示造模成功。治療過程中隔藥灸組和SASP組大鼠各死亡1只，模型組大鼠死亡2只。

1.3 治療

正常組（n=10）：同步飼養，無任何干預，只做與各干預組相同的抓取固定。

模型組（n=10）：造模后無其它干預，只做與各干預組相同的抓取固定。

隔藥灸組（n=10）：造模結束即日起開始干預，取天樞（雙）、氣海穴，將附子、肉桂、丹參等藥研末（上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院藥劑科提供）過100目篩，加黃酒拌成厚糊狀，用模具壓制而成直徑0.5 cm，厚0.3 cm的藥餅，置于所選穴位上，選用精制艾絨（南陽漢醫艾絨廠）制約90 mg 重艾炷，置于藥餅上，點燃施灸，每次每穴灸2壯，每日1次，共14次。

SASP組（n=10）：柳氮磺胺吡啶腸溶片（上海三維制藥有限公司，批號：200807C30）溶液灌胃。每日投藥量按成人（體重70 kg）與大鼠（體重200 g）1:0.018的比例（據《藥理實驗方法學》）配制SASP溶液，每日2次，共14次。

1.4 標本采集

治療結束后，大鼠24 h禁食、不禁水，按照50 mg·kg-1劑量2%戊巴比妥鈉腹腔注射，待大鼠麻醉后，剖腹取大鼠遠端結腸6 cm左右。沿腸系膜縱行剖開，用預冷的4℃生理鹽水沖洗后，將截取的結腸分為兩段，其中一段液氮中保存，待測；另一部分以10%的中性甲醛溶液固定，待測。

1.5 免疫印跡法檢測大鼠結腸組織的TLR4和TNF-α

將大鼠結腸組織從-80℃冰箱中取出，置入勻漿器中，把組織剪切成細小的碎片；按照每20 mg組織加入100 μL裂解液的比例加入RIPA裂解液；冰浴勻漿，充分裂解后，12 000 rpm離心5 min，取上清；取部分上清蛋白用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度；取蛋白提取液40 μL加至樣品孔中，留一孔加10 μL預染的Marker，接通電源，先用70 V恒壓電泳，約30 min，后改用90 V恒壓電泳1.5 h，當指示劑到達距凝膠下端約0.5 cm處時關閉電源，取出膠板；將膠浸泡于轉移緩沖液中平衡15 min，按黑面（負極）→海綿→濾紙→膠→PVDF膜→濾紙→海綿→紅面（正極）的順序制備轉膜“三明治”，每層鋪好后先趕走氣泡再鋪另一層。在轉移緩沖液中制備三明治可避免氣泡的產生；接上正負極，按膜向正極的方向將轉移盒放入電轉儀中，加入轉膜緩沖液；將電轉儀置于冰水中，200 mA恒流轉膜30 min、90 min；轉膜結束后，快速取出PVDF膜，放入5%BSA室溫封閉2 h；取出膜，于搖床上用TBST洗膜5 min×3次；孵育袋中加入封閉液稀釋的TLR4 （weiao 1:1 000）、TNF-a （weiao 1:500 ）和GAPDH（weiao 1:2 000），4℃孵育過夜；TBST洗膜5 min×3次，辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗（Jackson 1:2 000）和辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗小鼠二抗（Jackson 1:2 000）室溫孵育2 h；TBST洗膜15 min×5次。膜于化學發光檢測試劑（試劑A:試劑B=1:1）反應2 min，取出膜，甩去多余的液體，用保鮮膜包好PVDF膜，暗室中用X膠片感光、顯影、定影。

1.6 大鼠結腸組織TLR3、TLR4 mRNA的FQPCR檢測

從結腸組織抽提總RNA，按FQ-PCR試劑盒（QIAGEN公司，批號：QIAGEN204054）說明書進行逆轉錄反應合成cDNA，按ABI ViiA7 PCR儀（美國ABI 公司）的說明書將cDNA 進行PCR擴增。RNA提?。涸诰G豆大小的組織中加1 mL Trizol，用Tissue Ruptor勻漿器1 min，室溫放置10 min；加200 μL氯仿，充分混勻，15 000轉離心5-7 min；取上清，至1.5 mL Eppendorf管加600 μL氯仿，混勻，15 000轉離心5 min；取上清，至1.5 mL Eppendorf管加500 μL異丙醇，混勻，15 000轉離心10 min；棄上清，用75%乙醇1 mL沖洗，高速離心5 min；棄上清，RNA沉淀于空氣中干燥（2-3 min）；將干燥后的RNA溶解于RNA-free Water中；取1 μL總RNA測OD260，并定量。逆轉錄：在1.5 mL離心管中依次加入下列反應物（體積為12.5 μL）：DEPC水（8-x）μL，RNA酶抑制劑（50 U·μL-1）0.5 μL，隨機引物（50 pM·μL-1）2 μL，RNA x μL（2 μg）。65℃恒溫處理5 min，室溫放置10 min，高速（高于5 000 g）離心5 s；依次在1.5 mL離心管加入下列反應物（加入之后總體積為20 μL）：RNA酶抑制劑（50 U·μL-1）0.5 μL，5× buffer（invitrogen）4 μL，dNTP MIX（10 mM/each）2 μL，DTT 2 μL，AMV（200 U·μL-1）1 μL，水浴40℃下反應1 h；90℃處理5-10 min；冰浴5 min；高速離心5 s。

熒光定量PCR擴增：序列與引物設計的序列參照Gene Bank 數據庫中各目的基因的序列（見表1），引物由ABI公司的Primer Express Software v2.0設計，由華大基因公司合成。PCR反應體系（16 μL）：H2O 5 μL，2×SYBGEEN PCR mix 8 μL，Primer（10 pM·μL-1）1 μL，Primer（10 pM·μL-1）1 μL，cDNA 1 μL。反應條件：95℃ 2 min，94℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 40 s，循環40次。

1.7 統計學處理

數據采用SPSS for Windows 18.0統計軟件進行統計學處理。計量資料采用均數±標準差表示，對數據作正態性檢驗。數據符合正態分布，采用One-way ANOVA，方差齊同時采用LSD比較組間差異性，方差不齊時用Games-Howell比較組間差異性，P＜0.05作為差異有統計學意義；數據不符合正態分布，采用Mann-Whitney檢驗非參數檢驗。

2 結果

2.1 大鼠結腸組織病理學觀察

在光學顯微鏡下，正常組結腸黏膜結構清晰，腸腺排列整齊、規則，結腸黏膜上皮完整，固有層可見散在淋巴細胞，無明顯的炎性細胞浸潤。模型組結腸黏膜可見黏膜缺損，黏膜絨毛破壞或缺失，黏膜及黏膜下層有大量單核細胞、巨噬細胞浸潤，局部有充血水腫、腺體破壞或消失、潰瘍形成。隔藥灸組和SASP組結腸黏膜上皮及腸腺結構較為清楚，排列較模型組規則，潰瘍已基本愈合，表面由新生上皮細胞所覆蓋，部分仍有黏膜下水腫，炎性細胞浸潤（見圖1）。由此可知，與模型組比較，隔藥灸組和SASP組大鼠結腸組織病理學損傷均有一定的改善。

2.2 大鼠結腸黏膜TLR4和TNF-α蛋白表達

模型組UC大鼠結腸黏膜TLR4和TNF-α的相對表達量明顯高于正常組，隔藥灸組與SASP組模型大鼠結腸黏膜TLR4和TNF-α的相對表達量較模型組明顯下調（見表2、圖2）。

表1 引物探針序列

圖1 各組在光學顯微鏡下的組織

表2 大鼠結腸黏膜TLR4和TNF-α的相對表達量

圖2 TLR4和TNF-α的相對表達情況

2.3 大鼠結腸黏膜TLR4 mRNA表達

與正常組相比，模型組大鼠結腸黏膜的TLR4 mRNA的表達明顯升高（P＜0.01）；隔藥餅灸組和SASP組大鼠結腸黏膜的TLR4 mRNA的表達明顯低于模型組（P＜0.01）；隔藥餅灸組結腸黏膜TLR4 mRNA表達與SASP組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

2.4 大鼠結腸黏膜TNF-α mRNA表達

與正常組相比，模型組大鼠結腸黏膜的TNF-αmRNA的表達明顯升高（P＜0.05）；隔藥餅灸組和SASP組大鼠結腸黏膜的TNF-αmRNA的表達明顯低于模型組（P＜0.05）；隔藥餅灸組結腸黏膜TNF-αmRNA表達與SASP組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

3 討論

TLRs是與UC關系密切的模式識別受體。腸道粘膜上皮細胞、內分泌細胞、固有層的巨噬細胞、樹突狀細胞、纖維母細胞，以及微血管內皮細胞均表達該受體，在腸粘膜免疫中發揮重要作用[18-20]。目前的研究認為，TLRs是在UC發生中扮演重要角色[21]，內毒素（Lipopolysaccharide，LPS）介導的細胞信號轉導通路在UC的炎癥反應中起了至關重要的作用，TLR4是第一個被發現存在于人細胞表面與LPS跨膜信號轉導密切相關的TLR，是LPS跨膜信號轉導的關鍵受體之一[22，23]。有關研究顯示，UC患者的TLR4表達上調[24]。本研究發現，UC大鼠結腸組織TLR4的蛋白和mRNA表達明顯上調，艾灸干預后TLR4的蛋白和mRNA表達均下調，這表明艾灸可能通過調節TLR4的表達從而改善UC腸道炎癥反應。

表3 大鼠結腸黏膜TLR4 mRNA表達的影響

表3 大鼠結腸黏膜TLR4 mRNA表達的影響

注：與正常組相比，*P＜0.01，與模型組相比，＃P＜0.01。

表4 大鼠結腸黏膜TNF-α mRNA表達的影響

表4 大鼠結腸黏膜TNF-α mRNA表達的影響

注：與正常組相比，*P＜0.05，與模型組相比，＃P＜0.05。

TNF-α是促炎癥細胞因子，是機體炎癥反應和免疫應答的重要調節因子[25]。TNF-α通過誘導一氧化氮合酶（inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS），使NO增加，引起炎癥，并通過刺激單核細胞和巨噬細胞合成和釋放IL-1和IL-8等使炎癥進一步加重，在UC的發病中發揮重要作用[26]。本研究發現，UC大鼠結腸組織TNF-α的蛋白和mRNA表達明顯上調，這表明TNF-α參與了UC腸道炎癥反應；艾灸干預后TNF-α的蛋白和mRNA表達均下調，這表明艾灸可能通過調節TNF-α的表達抑制UC腸道炎癥反應。

根據其主癥，UC歸屬于中醫學的“腸澼”、“下利”、“久泄”、“久痢”等病癥范疇，其病機是脾胃虛弱為本，濕熱留滯為標。本研究采用隔藥灸療法進行干預治療，藥餅采用附子、肉桂、丹參、紅花、木香、黃連等配制而成，方中附子和肉桂均可溫陽散寒除濕，木香行氣調中止痛，三藥共伍可溫陽健脾，理氣和中以治其本；佐以黃連、丹參、紅花等藥而奏清熱利濕、理氣化瘀之效。因此，針灸治療UC不僅可以改善其臨床癥狀和病理特征，還可促進其炎性反應吸收和潰瘍修復，保護腸黏膜，促進腸黏膜的修復[27，28]，并能明顯改善UC模型大鼠腸道有益菌群的含量[16]以及菌群的多樣性[29]，對UC大鼠腸道微生態的保護作用。前期研究也發現，艾灸能有效地抑制UC模型大鼠TLR2信號通路中的上下游信號分子的異常表達，調節結腸黏膜局部過激的免疫反應，促進結腸黏膜損傷的修復[14]。本研究發現，UC模型大鼠結腸黏膜TLR4和TNF-α蛋白及mRNA表達均顯著增加，推測UC可通過TLR4信號通路產生炎性反應；隔藥灸和SASP均能下調潰瘍性結腸炎大鼠結腸TLR4和TNF-α的蛋白及其mRNA表達。因此，本研究認為對TLR4和TNF-α表達的調節可能是隔藥灸治療UC的重要機制之一。

總之，TLRs及其信號通路不僅參與了UC的發病過程，還在介導UC腸道黏膜免疫反應中發揮重要作用，而艾灸不僅能改善UC的結腸組織病理學改變，還通過調節TLRs受體及其介導的信號通路發揮免疫調節作用，促進UC結腸黏膜損傷的修復。

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Effect of Herb-partition Moxibustion on Protein and mRNA Expressions of TLR4 and TNF-α in Rats with Ulcerative Colitis

Wang Xiaomei1, Huang Yan1, Wang Yuanyuan2, Liu Yanan2, Qi Qin2, Jin Feng3, Hua Xuegui1, Wu Huangan1
(1. Shanghai Research Institute of Acupuncture-Moxibustion and Meridian, Shanghai 200030, China; 2. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; 3. Fudan University Shanghai Cancer Center, Shanghai 200032, China)

This study was aimed to observe the effect of herb-partition moxibustion on the protein and mRNA expressions of Toll-like receptor 4 (TLR-4) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in rats with ulcerative colitis (UC), and to further explore the mechanism of herb-partition moxibustion on UC. A total of 40 male SD rats wererandomly divided into four groups: the normal group, the model group, the herb-partition moxibustion group and the sulfasalazine (SASP) group. Herb-partition moxibustion was used onTianshuandQihaiacupoint in the herbpartition moxibustion group, and SASP gavage was used in the SASP group. The colonic pathological change was detected by HE staining. Protein and mRNA expression of TLR-4 and TNF-α were detected by western blot and FQ-PCR methods, respectively. The results showed that pathological damages appeared in colon tissues of the model rats. Compared with the model group, the colon pathological damage was improved in the herb-partitioned moxibustion group and the SASP group. Protein and mRNA expression of TLR-4 and TNF-α were significantly increased in the model group rats compared with the normal group (P＜0.05). After herb-partitioned moxibustion and SASP treatments, the protein and mRNA expression of TLR-4 and TNF-α were significantly decreased (P＜0.05). It was concluded that TLR-4 and TNF-α may play an important role in inflammatory injury of UC. Herb-partitioned moxibustion can reduce the expression of TLR-4 and TNF-α. It suggested that the underlying mechanism may be the down-regulation of the cascade reaction mediated by TLR4 and TNF-α expression to achieve the purpose of moxibustion to treat UC.

Moxibustion therapy, ulcerative colitis, Toll-like receptor 4, tumor necrosis factor-α

10.11842/wst.2016.03.008

R245

A

（責任編輯：馬雅靜 張志華，責任譯審：王 晶）

2016-02-14

修回日期：2016-03-04

＊ 國家自然科學基金委面上項目（81473758）：艾灸調節潰瘍性結腸炎腸道菌群多樣性及艾灸血清對其LPS信號通路的作用機制研究，負責人：王曉梅；上海市教委科研創新項目（2014YZ052）：艾灸對潰瘍性結腸炎患者腸道菌群的調節作用及其效應機制，負責人：王曉梅；科學技術部國家重點基礎研究發展計劃“973計劃”項目（2015CB554501）：艾灸效應的啟動機制及其內源性調節作用的機理研究，負責人：吳煥淦；上海市人才發展資金（2014068）：艾灸對潰瘍性結腸炎腸道菌群多樣性的調節作用及其效應機制研究，負責人：王曉梅。

＊＊ 通訊作者：吳煥淦，本刊編委，教授，博士生導師，主要研究方向：針灸作用的基本原理與應用規律研究。