溫和灸對潰瘍性結腸炎大鼠天樞穴P2RX7的作用機理研究＊

黃 艷，趙繼夢，關 鑫，張建斌，竇傳字，施 征，劉慧榮，王曉梅＊＊，吳煥淦＊＊

（1.上海市針灸經絡研究所 上海 200030；2.上海中醫藥大學附屬曙光醫院 上海 201203；3.南京中醫藥大學第二臨床醫學院 南京 210023）

溫和灸對潰瘍性結腸炎大鼠天樞穴P2RX7的作用機理研究＊

黃 艷1，趙繼夢1，關 鑫2，張建斌3，竇傳字1，施 征1，劉慧榮1，王曉梅1＊＊，吳煥淦1＊＊

（1.上海市針灸經絡研究所 上海 200030；2.上海中醫藥大學附屬曙光醫院 上海 201203；3.南京中醫藥大學第二臨床醫學院 南京 210023）

目的：潰瘍性結腸炎（UC）是艾灸治療的有效病癥，本研究從艾灸作用的始動環節與穴位響應密切相關的角度，探討溫和灸的對穴區P2X嘌呤受體7表達的影響。方法：將20只SD雄性大鼠隨機分成正常組6只、模型組14只。采用自由飲用4%葡聚糖硫酸鈉（DSS）法建立UC模型，連續飲用7天后，取2只大鼠進行模型鑒定，造模成功后將剩下的12只大鼠隨機分成UC組、UC+溫和灸組，第8天改為自由飲用1% DSS溶液，第8天開始采用溫和灸天樞穴（雙）干預7天，每天10 min。療程結束后，稱量大鼠體質量、取雙側天樞穴皮膚，采用HE染色觀察病理組織學形態變化，采用免疫組化法對P2RX7的蛋白檢測，從分子水平觀察溫和灸對天樞穴皮膚的作用；采用qRT-PCR的方法檢測P2RX7在天樞穴皮膚中的表達。結果：與正常組比較，UC組體質量于第4天開始明顯降低（P＜0.05），天樞穴P2RX7基因的mRNA表達水平降低（P＜0.05），天樞穴皮膚中主要分布在真皮層皮脂腺中的P2RX7明顯減少（P＜0.05）。與UC組比較，UC+溫和灸組在第8天明顯增加（P＜0.05），天樞穴P2RX7基因mRNA表達水平增高（P＜0.05），天樞穴皮膚P2RX7主要分布在皮脂腺中的明顯增加（P＜0.05）。溫和灸干預后所增加體重與天樞穴P2RX7免疫組化IOD值的相關系數r=0.823（P＜0.05）。結論：溫和灸能明顯增加UC大鼠體重，其起效的機制可能與上調天樞穴位皮膚P2X嘌呤受體7密切相關。

潰瘍性結腸炎溫和灸天樞穴區P2RX7

艾灸是中國傳統醫學的經典治療方法之一，被廣泛應用于多個系統疾病的臨床防治。穴位是艾灸療法施灸的重要體表部位，與臟腑經絡之氣相通，是艾灸發揮作用、取得臨床療效的關鍵。艾灸作用的始動環節與穴位響應密切相關，研究穴位局部結構與功能是探討艾灸作用機制的有效切入點[1，2]。本課題前期研究結果提示，潰瘍性結腸炎是艾灸療法的一種有效腸腑病癥，艾灸能調節其免疫炎癥因子達到抗炎的作用，但其潛在的效應啟動機制尚未明確[3，4]。據報道，不同生理病理狀態下艾灸足三里穴對穴位局部具有不同的作用效應，其差異性表達基因涉及的通路與嘌呤信號通路密切相關[5]。因此，研究艾灸對穴位的嘌呤信號通路在穴位局部的作用規律及作用特點，為揭示艾灸的作用機制提供重要信息。

潰瘍性結腸炎是艾灸的有效病種，以往有研究從穴位局部解剖、局部肥大細胞脫顆粒，辣椒素受體（Transient Receptor Potential Vanilloid，TRPV）等方面對艾灸效應的局部變化進行了深入研究，嘌呤受體是與免疫炎癥密切相關的分子[6-10]。研究表明，免疫細胞中表達多種P2X受體，其中P2RX7在免疫反應與炎癥中具有重要作用，人單核細胞表達功能性P2RX7，并耦聯IL-1β和IL-18釋放，參與LPS依賴的免疫細胞激活，ATP通過P2X7引發受LPS處理過的單核/巨噬細胞釋放IL-1β和激活核因子NF-κB及MAPK信號系統[11]。本研究以葡聚糖硫酸鈉（Dextran Sulfate Sodium Salt，DSS）誘導的潰瘍性結腸炎（Ulcerative Colitis，UC）作為研究載體，以艾灸雙側天樞穴為干預方式，采用免疫組化、聚合酶鏈式反應等方法研究艾灸對穴位局部P2RX7的影響，從嘌呤受體角度為艾灸治療UC提供新的實驗資料。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

清潔級雄性SD大鼠20只，體質量200±20 g，由上海中醫藥大學動物實驗中心提供[使用許可SYXK（滬）2009-0069]，動物飼養環境溫度在20℃，濕度保持在60%-70%左右，自由進食和飲水，適應性喂養1周后，隨機分成2組，正常組6只和模型組14只。每天稱量大鼠體重。

1.2 建立大鼠UC模型[12]

給14只UC模型組的大鼠連續自由飲用4% DSS （分子量：36 000-50 000，貨號9011-18-1，MP Biomedicals公司，規格：500GM）水溶液7天，取2只大鼠進行模型鑒定，造模成功后將12只大鼠隨機分成UC模型組、溫和灸組，改為連續自由飲用1% DSS溶液7天維持。

表1 P2RX7及內參GAPDH的引物序列

1.3 艾灸干預措施

溫和灸于造模成功后第8天開始介入，提前一天剔除腹部的鼠毛，暴露雙側天樞穴，在距離“天樞穴”2 cm處，每天每穴溫和灸10 min，共7天。正常組和UC模型組不干預，給予相同的固定。“天樞穴”根據《實驗針灸學》教材定位。艾條規格（大鼠實驗專用）：圓柱狀，直徑7 mm、長120 mm，重量2 g（南陽漢醫艾絨有限責任公司）。

1.4 HE染色

采用電腦全自動脫水機進行組織脫水、透明和浸蠟，石蠟切片機進行連續切片厚度為4 μm，二甲苯I、II脫蠟各20 min；100%、95%、85%、75%酒精各3 min；蘇木精染色1 min；1%鹽酸乙醇液（鹽酸1份+70%乙醇100份）分色；0.5%水溶性伊紅染色5 min；顯微鏡觀察患者腸組織病理形態并評分。

1.5 實時定量PCR

采用Trizol法（美國invitrogen公司，貨號：15596026）提取組織總RNA，用Nanodrop超微量分光光度計檢測總RNA的濃度及純度。每個樣本取4 mg總RNA用逆轉錄試劑盒（美國Thermo公司，批號：K1622）逆轉錄成cDNA，100 ng cDNA模板加200 nM引物采用SYBR Green（德 國QIAGEN公司，貨號：204243）在 ABI 7300 型熒光定量 PCR儀（ABI Prism 7300 SDS Software）上擴增。P2RX7mRNA的相對表達量以 2-ΔΔCt表示（ΔCt=目的基因Ct 值－內參基因Ct值）。引物序列如下，見表1：

1.6 免疫組化

采用免疫組織化學Envision法檢測。石蠟切片脫蠟至水；20%正常羊血清37℃濕盒孵育30 min，一抗（Rabbit anti-P2RX7，1:100，美國 Sigma公司，貨號：AV35518），4℃孵育過夜；加HRP標記二抗（小鼠抗兔）37℃孵育60 min；DAB染色，蘇木精復染，0.1%鹽酸酒精分化，顯微鏡下觀察；中性樹膠封片。每張片子隨機選取3個視野，IPP圖像分析系統獲得統計量陽性積分光密度（Integral Optical Density，IOD）。

1.7 統計學分析

采用SPSS 18.0統計軟件，所有計量資料均用均數±標準差表示，符合正態分布的數據采用單因素方差分析比較組間差異，不符合正態分布的數據采用非參數檢驗，P＜0.05表明差異有統計學意義。符合正態分布的雙變量相關分析采用Pearson相關系數r表示，說明具有直線相關的兩變量間相關的密切程度與相關方向。

2 結果

2.1 溫和灸對UC大鼠的體重評分比較

與正常組比較，UC組的大鼠體重于第4天明顯降低，持續到第13天（P＜0.05），提示4%DSS誘導的UC大鼠體重明顯降低。與UC組的大鼠體重比較，溫和灸組的大鼠體重于第8天開始明顯增加，持續到第13天（P＜0.05），提示溫和灸有改善UC大鼠體質量的作用。見圖1。

圖1 3組大鼠體重比較

2.2 溫和灸對大鼠的天樞穴皮膚HE染色比較

與正常組比較，UC組大鼠天樞穴皮膚HE染色無明顯差異，提示4%DSS并不影響大鼠天樞穴皮膚的形態與結構（P＞0.05）；與UC組比較，溫和灸組大鼠天樞穴皮膚HE染色結果提示，細胞形態及大小均無明顯差異，提示溫和灸不能改變大鼠天樞穴皮膚形態與結構（P＞0.05）。見圖2。

圖2 3組大鼠天樞穴皮膚的組織形態學比較 (200×)

2.3 溫和灸對大鼠天樞穴皮膚P2RX7基因mRNA表達的影響

與正常組比較，UC組的大鼠天樞穴皮膚中基因P2RX7的表達水平明顯降低（P＜0.05），提示4%DSS誘導UC后穴位皮膚在mRNA層面上P2RX7表達下調。與UC組比較，溫和灸組基因P2RX7的表達水平明顯增加（P＜0.05），提示溫和灸能在mRNA層面上調P2RX7的表達。見圖3。

2.4 溫和灸對大鼠天樞穴皮膚P2RX7的免疫組化觀察

與正常組比較，UC組的大鼠天樞穴皮膚中P2RX7的表達水平降低，在皮脂腺中表達明顯減少（P＜0.05），提示4%DSS誘導的UC大鼠天樞穴位局部P2X嘌呤受體7明顯降低。與UC組比較，溫和灸組中天樞穴皮膚中P2RX7蛋白的表達水平增加，在皮脂腺中表達明顯上升（P＜0.05），提示溫和灸能改善因DSS誘導引起的天樞穴皮膚中嘌呤受體P2RX7的表達，其表達水平接近正常組。見圖4、圖5。

2.5 溫和灸增加UC大鼠體重與天樞穴皮膚P2RX7免疫組化IOD值結果的相關性分析

4%DSS誘導的UC大鼠體重較正常組增長減慢，但溫和灸天樞穴干預7天后大鼠的體重增長加快。溫和灸干預7天后較干預前所增加體重與天樞穴P2RX7免疫組化IOD值呈正相關，Pearson相關性r=0.823（P＜0.05）。見圖6。

3 討論

本研究首次發現4%DSS誘導的大鼠天樞穴區P2RX7表達均降低，溫和灸干預天樞穴后局部P2RX7表達均增高，明確了艾灸對穴位局部嘌呤受體P2RX7的表達影響。實驗結果顯示：溫和灸能增加UC大鼠的體重，改善機體的體質量；在mRNA和蛋白層面，溫和灸均能上調因4%DSS誘導UC大鼠天樞穴中減少的P2RX7的表達，艾灸療法促進了P2RX7基因的轉錄和翻譯，尤其在穴位局部真皮層分泌皮脂的皮脂腺中。最新研究發現，大鼠皮脂腺內有神經肽Y、降鈣素基因相關肽（CalcitoninGene-Related Peptide，CGRP）等物質，最主要的功能是合成和分泌皮脂，常常以微泡形式分泌包括多種物質的皮脂：甘油三酯、半乳糖、乙酰氨基葡糖、維生素E及抗菌肽等，在脂質微粒表面及內部含有組蛋白H3和Perilipin A蛋白[13]。皮脂腺的分泌常常受溫度和雄性激素的調控，皮脂腺在艾灸（溫和灸）治療溫度升高時皮脂分泌增加，皮脂腺細胞本身能產生促腎上腺皮質激素釋放激素（Corticotropin Releasing Hormone，CRH），通過自分泌、旁分泌方式與CRH受體結合，及與胞內腺苷酸環化酶cAMP作用影響皮脂腺的分泌功能。其功能調節十分復雜，調節炎性細胞因子的表達，參與免疫過程[13]。因此，皮脂腺功能與機體內部神經-內分泌-免疫系統網絡間可相互作用，而其中腺苷作為能量直接參與皮脂腺功能的調控，可能與嘌呤受體P2RX7功能密切相關。此外，溫和灸干預UC大鼠7天后，增加了其體重，改善了其體質量，其所增體重與溫和灸天樞穴引起P2RX7免疫組化的IOD值的直線相關性用散點圖（圖6）表示，該圖提示兩變量變化趨勢同時增大、趨勢相同，為正相關，相關系數r大于0.75（P＜0.05）被認為相關程度較高。

圖3 3組大鼠天樞穴皮膚基因P2RX7表達水平比較

圖4 3組大鼠天樞穴皮膚P2RX7蛋白表達水平比較

相關研究發現，穴位與非穴位的微量元素不同，在腧穴部位Ca2+濃度明顯高于非穴位，并且Ca2+是針刺效應機制的重要環節[7，14]；艾灸后穴位局部細胞外K+濃度增高[1]，可能與艾灸產生的效應機制密切相關，鉀離子濃度是始動環節之一，但具體的機制尚不清楚。根據本研究的實驗結果，腧穴在針灸后微量元素的變化可能與ATP嘌呤受體P2X密切相關。P2X受體是通過蛋白質構型的改變直接控制內在的離子通道狀態的，不需經過膜和胞內信號轉導過程，所以反應速度非常快，P2X受體對Na+，K+，Ca2+這樣的小陽離子為非選擇性通透，導致細胞內Ca2+濃度升高，又可激活電壓依賴性Ca2+通道并促進細胞內儲存Ca2+的釋放，進一步增加細胞內Ca2+濃度，進而使細胞膜去極化。P2RX7可能參與了艾灸后穴位局部小陽離子通道選擇性調控[11]。穴位下的血管、小神經束、游離神經末梢或各種特殊感受器等組織結構和針灸的形成密切相關，它們共同構成穴位的感受裝置。這些裝置在接受到針灸刺激后，穴位下的肥大細胞釋放一些活性物質到組織中，包括P物質（SP）及血管活性腸肽（VIP）。神經受到刺激以后，ATP作為共遞質參與經典神經遞質/神經肽的共同釋放。在副交感神經系統，ATP、SP和CGRP共存與神經末梢的大顆粒囊泡中，三者在軸索反射中具有協同作用，而這些物質被認為是穴位后效應的物質基礎[15]。

艾灸對UC的效應作用從腧穴局部皮膚開始，經艾灸后的穴位局部皮膚結構與形態并無明顯改變，但P2RX7在基因和蛋白層面的表達水平明顯增加，且溫和灸干預UC大鼠所增加體重與天樞穴P2RX7免疫組化IOD值的呈正相關，其相關程度高。這說明局部的ATP能量發生顯著變化，可能是由于艾灸的熱刺激作用，激活了穴位表皮下的皮脂腺功能，釋放神經肽類物質，而與神經肽共同作用的ATP也被激活，嘌呤受體釋放增加，促進了小陽離子通透性改變，P2RX7在艾灸腧穴局部功能中扮演重要的角色。但是，其具體的機制還需要深入研究，有必要結合電生理及膜片鉗技術，觀察艾灸對穴位局部嘌呤受體、陽離子通道的影響，為艾灸的局部始動作用提供客觀的實驗室數據。

圖5 3組大鼠天樞穴皮膚P2RX7免疫組化定量比較

圖6 溫和灸增加UC大鼠體重與天樞穴皮膚P2RX7免疫組化IOD值的相關性

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Effect of Warming Moxibustion on P2RX7Regulation in Tianshu Acupoint Skin of Rats with Ulcerative Colitis

Huang Yan1, Zhao Jimeng1, Guan Xin2, Zhang Jianbin3, Dou Chuanzi1, Shi Zheng1, Liu Huirong1, Wang Xiaomei1, Wu Huangan1
(1. Shanghai Research Institute of Acupuncture and Meridian, Shanghai 200030, China; 2. Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; 3. The Second Clinical Medical College, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing, 210023, China)

Moxibustion is an effective treatment for ulcerative colitis (UC). Structure and function of acupoints are closely related to the response to moxibustion for patients. This study investigated purinergic receptor P2X7mRNA and protein expressions ofTianshuacupoint under warming moxibustion in UC rats. The 20 male SD rats were randomly divided into two groups: the normal group (n= 6) and the model group (n= 14). The model group rats were fed with 4% dextran sulfate sodium (DSS) for 7 days. Among the 14 rats, 2 rats were taken for identification of successful UC model before moxibustion treatment. The rest of 12 rats in the model group were randomly divided into the UC group, the UC and warming moxibustion group, and fed with 1% DSS solution. On the 8thday, warming moxibustion at bilateralTianshuhad been used in the UC and warming moxibustion group for 7 days, 10 minutes per day. Rats were weighed every day. After 7 days warming moxibustion, theTianshuacupoint skins of both sides were taken for HE staining and immunohistochemistry (IHC). The expression of P2X7onTianshuacupoint skin was detected by qRT-PCR. The results showed that compared with the normal group, the rat body weight decreased from the 4thday in the UC group (P＜0.05); and gene P2RX7expression level also significantly decreased in theTianshuacupoint skin (P＜0.05); P2RX7in the sebaceous glands of the dermis significantly decreased onTianshuacupoint skin (P＜0.05). Compared with the model group, the rat body weight increased from 8thday in the UC and warming moxibustion group (P＜0.05); and gene P2RX7expression level also significantly increased in theTianshuacupoint skin (P＜0.05); P2RX7in the sebaceous glands of the dermis significantly increased onTianshuacupoint skin (P＜0.05). It was positive correlation,r= 0.823(P＜0.05), between the body weight increased by warming moxibustion and the integrated option density (IOD) value of P2RX7 inTianshuacupoint skin in UC. It was concluded that warming moxibustion could significantly increase the body weight of UC rats. The underlying mechanism may be closely related to the upregulation of purinergic receptor P2X7expression inTianshuacupoint skin.

Ulcerative colitis, warming moxibustion,Tianshuacupoint skin, P2RX7

10.11842/wst.2016.03.010

R245

A

（責任編輯：馬雅靜 張志華，責任譯審：王 晶）

2016-02-14

修回日期：2016-03-04

＊ 上海市衛計委科研項目資助（20134013）：艾灸治療潰瘍性結腸炎結腸黏膜炎癥相關靶基因調控的機理研究，負責人：吳煥淦；國家重點基礎研究發展計劃“973計劃”項目（2015CB554501）：艾灸效應的啟動機制及其內源性調節作用的機理研究，負責人：吳煥淦；國家自然科學基金委面上項目（81574081）：艾灸對結腸炎相關性癌變的ATP-P2X7R的作用及調控機制研究，負責人：吳煥淦；上海中醫藥大學上海市重點學科資助項目（S30304-A9、S30304-A13）：艾灸煙氣安全性的流行病學調查研究，負責人：吳煥淦。

＊＊ 通訊作者：王曉梅，博士，副教授，碩士生導師，主要研究方向：針灸胃腸疾病的臨床與基礎；吳煥淦，本刊編委，博士，教授，博士生導師，主要研究方向：針灸作用的基本原理與應用規律研究。