ISSR分子標記在白芍親緣關系的應用研究＊

蔣雨晗，張麗萍，周學剛，王艷芳

（中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所 北京 100193）

ISSR分子標記在白芍親緣關系的應用研究＊

蔣雨晗，張麗萍＊＊，周學剛，王艷芳

（中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所 北京 100193）

目的：研究安徽、山東、北京、四川的栽培白芍和山西野生白芍的遺傳多樣性和親緣關系，確定不同產區的白芍種質資源的差異，為白芍育種研究提供一定參考。方法：運用ISSR分子標記技術，研究14份材料的遺傳多樣性水平。結果：選擇條帶清晰、多態性高、重復性好的7條引物進行擴增，共獲得56條片段，其中多態性條帶38條，平均多態性比率為67.86%；運用NTSYS軟件計算樣品間的遺傳相似系數（GS值），得到樣品間遺傳相似系數矩陣，其中亳州1號和亳州2號間相似系數最大，這說明兩者間親緣關系較近，遺傳差異小；北京2號和山西野生白芍相似系數最小，說明兩者間親緣關系較遠，遺傳差異大；利用UPGMA法，根據遺傳相似系數對各樣品進行聚類分析，在GS值為0.72時把14個樣品分為兩大類群，北京和安徽栽培白芍為一個類群，其他品種為另一個類群。結論：4個產區的栽培白芍和山西野生白芍存在一定的遺傳差異性，可以從基因水平把植株外型相似的栽培品種區分開，對新品種的選育有很大的意義。

白芍ISSR分子標記親緣關系

白芍為毛茛科芍藥屬芍藥PaeonialactifloraPall.經去皮水煮加工后的干燥根，具有養血調經、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽之功效[1]，主治胸脅疼痛、自汗盜汗、陰虛發熱、月經不調、崩漏帶下等癥[2]。白芍主要化學成分有芍藥苷、芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷等[3]。現代藥理研究表明，芍藥總苷具有止痛、抗炎、保肝以及多途徑抑制自身免疫反應等作用[4]，在心血管疾病和肝病的治療上已成為未來研究的重點[5]。白芍主產于中國安徽、四川、山東、浙江等地[6]，中國醫學科學院藥用植物研究所多年來對各產地白芍種質資源進行收集，并進行了初步品種選育篩選出數個品系，本研究把這數個品系作為北京產白芍列入研究范圍。

白芍是中國傳統常用大宗中藥材，種植面積大，品種繁多，但其種質資源的混亂阻礙了白芍的可持續發展。白芍品種的傳統鑒定方法主要從植株外型特征和化學成分上進行區分，隨著分子生物技術的發展，從分子水平對白芍種質資源有了更深一步的認識。ISSR分子標記技術近年來被廣泛應用于藥用植物品種鑒定、親緣關系以及遺傳多樣性的研究[7]。其中，于恒秀等[8]運用ISSR引物研究栽培芍藥品種間的親緣關系表明“藍田碧玉”與其他研究品種親緣關系較遠；王淼等[9]通過研究優化了芍藥ISSRPCR反應體系并把所研究的芍藥品種分為3個類群。目前，藥用白芍的相關報道較少，對各個產區栽培的藥用白芍的研究不夠全面。因此，本研究運用ISSR分子標記技術對4個產地的栽培白芍和山西野生白芍的親緣關系進行研究，分析白芍的遺傳多樣性，以期為白芍的育種提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

北京產白芍原植物種植于中國醫學科學院藥用植物研究所試驗田，經張麗萍研究員鑒定為毛茛科芍藥PaeonialactifloraPall.。樣品采集方法：每間隔5 m左右標記采樣單株，每株采集正常生長的新鮮葉片4-5片，放入裝有無水硅膠的自封袋中干燥。樣品情況見表1。

表1 試驗樣品情況

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取

取白芍葉片100 mg，采用CTAB法提取葉片基因組總DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性和純度。

1.2.2 ISSR反應體系和擴增條件

ISSR反應體系共20 μL：ddH2O 7.8 μL，（藍）MIX 10 μL，引物（100 μm）0.2 μL，DNA模板2 μL。ISSR-PCR擴增程序：94℃預變性10 min；94℃變性30 s，54℃復性30 s，72℃延伸2 min，共33個循環；最終72℃延伸10 min。擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后在紫外成像儀上觀察、拍照。

1.2.3 引物的篩選

通過查閱芍藥及其近緣科屬ISSR-PCR實驗的相關文獻，從中初步篩選出常用擴增的ISSR引物20條[10，11]（見表2）。選擇編號為1、3、5、8、9的5個樣本對這20條引物進行擴增，篩選出多態性高、穩定性好的引物以期為所有樣品的擴增。

表2 引物信息表

1.2.4 數據統計與分析

PCR擴增產物的電泳位置在凝膠的某個相同遷移率位置上，有DNA條帶記為1，無DNA條帶記為0。形成ISSR的表型數據矩陣，NTSYS軟件計算相似系數，并且按照遺傳距離進行UPGMA聚類分析。

2 結果與分析

2.1 引物篩選結果

從20條ISSR引物中篩選出了7條能夠擴增出清晰條帶且具多態性的引物，篩選出的引物編號：0531-018、UBC881、UBC808、UBC811、UBC835、UBC836、UBC842。

2.2 ISSR-PCR實驗結果

利用ISSR分子標記技術對14份白芍樣本進行遺傳多樣性分析，從20條引物中篩選出7條能夠擴增出清晰條帶且具多態性的引物，共獲得56條清晰可辨條帶，其中多態性條帶 38條，平均多態性比率為67.86%，擴增的DNA片段集中在200-2 000 bp上下。平均每對引物擴增出8條條帶，其中5.429條具有多態性。其中，多態性最高的為87.50%，低的只有57.14%。其中引物0531-018對14份白芍種質資源擴增圖（圖1）。7條引物總體擴增情況見表3。

2.3 樣本親緣關系的分析

2.3.1 遺傳相似系數

利用7條引物在14份白芍葉片獲得的56條擴增片段，在NTSYS軟件中計算樣品間的遺傳相似系數（GS值），得到供試材料遺傳相似矩陣（見表4）。遺傳相似系數越大，表明親緣關系越近，遺傳相似系數越小，表明親緣關系越遠。由表3可知14份樣品的GS值范圍為：0.625 0-1.000 0，變幅為0.375。其中，亳州1號、亳州2號樣品之間的遺傳相似系數最大為1.000 0，表明兩者之間的親緣關系較近，遺傳差異性小。北京1號、北京2號和山西野生品種，北京2號和山東昆山霞光樣品之間的遺傳相似系數最小為0.625 0，表明這幾個樣品之間的親緣關系較遠，遺傳差異性較大。由遺傳相似系數可知，供試樣品之間有較大的遺傳差異性。

2.3.2 聚類分析

根據遺傳相似系數矩陣，利用UPGMA法進行聚類分析，聚類圖見圖2。

圖1 引物 0531-018 對 14 份白芍種質資源擴增圖譜

表3 7對引物擴增結果統計

表4 14個樣本遺傳相似系數矩陣

圖2 14份白芍種質材料的UPGMA聚類圖

由以上聚類分析圖可以看出，在GS值為0.72時把14份樣本分為兩大類：①北京品種和安徽品種；②其他品種。其中，北京和安徽品種均為單瓣花型，四川和山東品種為重瓣花型。這也與實驗分析結果基本一致，說明單瓣型白芍和重瓣型白芍具有明顯的差異性，同時發現山西野生單瓣型白芍和重瓣的栽培品種遺傳差異性較小。從遺傳相似系數和聚類分析圖可知，亳州1號和亳州2號基本沒有遺傳差異，而北京品種和安徽品種具有一定的遺傳差異，從分子水平可以把兩者區分開。

根據以上遺傳差異性分析結果可知，不同產區的白芍具有一定的遺傳差異性，而同一產區不同品種之間也存在差異。本次研究結果表明，北京和安徽兩個產區栽培白芍親緣關系較近，山西野生品種和四川、山東產區栽培白芍親緣關系較近，而北京、安徽產區的白芍和山東、四川以及山西野生品種的白芍親緣關系較遠。

3 討論

運用ISSR分子標記技術對安徽、北京、山東及四川栽培品種白芍和山西野生白芍進行研究，安徽和北京栽培品種在植株外型上都屬于單瓣花型，山東和四川栽培品種植株外形上屬于重瓣花型，從基因水平上對栽培白芍進行研究，更具體的確定栽培白芍品種間的遺傳距離和親緣關系的遠近。

本研究結果表明，ISSR分子標記技術能有效檢測栽培白芍種質材料的遺傳多樣性，揭示白芍遺傳背景，從聚類分析圖可以判別栽培白芍遺傳距離的大小和親緣關系的遠近，對選育新品種具有重要的意義。

另外，本次實驗所選引物多是從哥倫比亞大學設計并所公布的100條引物中選取，共性大。可以對芍藥屬引物進一步開發，使引物更具有各自的特性，實驗結果更明確。

1 國 家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部).北京:中國醫藥科技出版社, 2015: 105.

2 李 雪蓮,來平凡.白芍品種的本草學研究及現代實驗研究.亞太傳統醫藥. 2008, 4(5): 36-38.

3 Z hu S,Yu X, Wu Y. Genetic and chemical characterization of white and red peony root derived from Paeonia lactiflora.J Nat Med-Tokyo, 2015, 69(1): 35-45.

4 李 文艷,黃山君,王瑞.中藥白芍的藥理作用和質量控制研究進展.藥學服務與研究. 2012, 12(2): 118-122.

5 王 秋玲,馬運運,孫云波,等. 藥用芍藥發明專利格局與發展分析.世界科學技術-中醫藥現代化. 2014, 16(7): 1476-1481.

6 查 良平,楊俊,彭華勝,等.四大產地白芍的種質調查. 中藥材. 2011, 34(7): 1037-1040.

7 孫 稚穎,姚輝,王振中,等.金銀花種質資源遺傳多樣性的ISSR分析.世界科學技術-中醫藥現代化. 2013, 15(9): 1890-1895.

8 于 恒秀,王淼,梁國華,等. ISSR引物鑒定芍藥栽培品種之間親緣關系的初步研究. 植物生理學通訊. 2006, 42(2): 271-274.

9 王 淼,于恒秀,龔志云.芍藥栽培品種ISSR反應體系的優化和應用.揚州大學學報(農業與生命科學版). 2007, 28(2): 78-82.

10 周 佐斌. 白芍原植物種質資源遺傳多樣性的ISSR分析.南昌:南昌大學, 2007, 59.

11 索 立志.利用DNAISSR分子標記技術對芍藥屬植物栽培品種的分類鑒定方法.生物技術通報. 2008,增刊: 109-112.

Application Research on Relationship of Paeonialactiflora Pall. by ISSR

Jiang Yuhan, Zhang Liping, Zhou Xuegang, Wang Yanfang
(Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China)

The purpose of this experiment was to study the genetic diversity and phylogenetic relationship ofPaeonialactifloraPall. from Anhui, Shandong, Beijing, Sichuan and Shanxi, and to provide guidance for the germplasm and breeding research inPaeonialactifloraPall. Inter-simple sequence repeat (ISSR) was conducted to assess the genetic diversity of 14PaeonialactifloraPall. cultivars. The results showed that 7 ISSR primers with clear and stable polymorphic bands were selected. In the 56 fragments obtained, 38 were polymorphisms, and the percentage of polymorphic fragment was up to 67.86%. The GS was calculated by NTSYS, among the coefficient matrix of 14PaeonialactifloraPall. The GS between Bozhou 1 and Bozhou 2 were the highest, which indicated they had lower genetic diversity level, while Beijing 2 and Shanxi were opposite. Based on UPGMA and ISSR molecular markers, the 14PaeonialactifloraPall. cultivars were divided into two groups at the GS of 0.72. Beijing and Anhui were in one group, others were in the other group. It was concluded that a higher genetic diversity level among the 14PaeonialactifloraPall. cultivars and they can be distinguished on genetic level. The result was significant for the breeding.

PaeonialactifloraPall., ISSR molecular markers, phylogenetic relationship

10.11842/wst.2016.03.015

R931.2

A

（責任編輯：馬雅靜 張志華，責任譯審：王 晶）

2015-11-10

修回日期：2016-01-07

＊ 科學技術部國家科技重大專項“重大新藥創新”項目（2012ZX09304006-056）：中藥材種子種苗和種植（養殖）標準平臺，負責人：張麗萍。

＊＊ 通訊作者：張麗萍，研究員，主要研究方向：藥用植物規范化種植。