扶正排毒片對(duì)氫化可的松致免疫抑制小鼠外周血T淋巴細(xì)胞及免疫器官的影響＊

史晶晶，時(shí) 博，苗明三，李青雅

（河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 鄭州 450046）

扶正排毒片對(duì)氫化可的松致免疫抑制小鼠外周血T淋巴細(xì)胞及免疫器官的影響＊

史晶晶，時(shí) 博＊＊，苗明三，李青雅

（河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 鄭州 450046）

目的：本研究通過(guò)觀察扶正排毒片對(duì)免疫抑制小鼠血細(xì)胞免疫功能的影響以及免疫器官的病理變化，探討其對(duì)免疫的調(diào)節(jié)作用。方法：采用皮下注射氫化可的松造動(dòng)物免疫抑制模型。通過(guò)連續(xù)灌服不同劑量的扶正排毒片混懸液，觀察扶正排毒片對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外周血CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞水平、CD4+/CD8+比值的影響及動(dòng)物胸腺、脾臟、小腸的病理改變。結(jié)果：與模型組比較，扶正排毒片高、中、低劑量組與香菇多糖組均能顯著提高免疫抑制小鼠CD3+、CD4+細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)CD4+/CD8+比值增高。結(jié)論：扶正排毒片可改善氫化可的松致免疫抑制模型小鼠的免疫功能。

扶正排毒片 免疫抑制 氫化可的松

艾滋病全稱為獲得性免疫缺陷綜合征（Acquird Immune Deficiency Syndrome，AIDS），HIV感染后，導(dǎo)致免疫功能缺陷，易發(fā)生機(jī)會(huì)性疾病，包括感染和惡性腫瘤，人體從HIV感染到AIDS發(fā)病，大致經(jīng)過(guò)3個(gè)時(shí)期。無(wú)癥狀帶毒期(Assympto matic Carrier，AC)、AIDS相關(guān)癥候群期(AIDS related complex，ARC)、最后發(fā)展成AIDS[1,2]。目前世界上公認(rèn)的治療艾滋病有效療法為高效抗逆轉(zhuǎn)錄酶病毒聯(lián)合療法，但對(duì)還未達(dá)到應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的無(wú)癥狀期HIV 感染者，卻無(wú)適宜的藥物治療，只有等到病情的發(fā)展達(dá)到抗病毒治療指征時(shí)才應(yīng)用抗病毒藥物治療[3-5]。

扶正排毒片是河南中醫(yī)學(xué)院針對(duì)無(wú)癥狀期HIV感染者“正氣不足、邪毒內(nèi)伏”的病機(jī)[6]，乏力、氣短、納差、便溏、自汗盜汗、易感外邪、頭暈、倦怠等癥狀而研制的中藥新藥，本研究通過(guò)以氫化可的松造免疫抑制動(dòng)物模型模擬HIV無(wú)癥狀期免疫低下狀態(tài)，觀察扶正排毒排對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

扶正排毒片，主要成分為西洋參、黃芪、紫草、連翹、白花蛇舌草、甘草等（河南奧林特藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20070601)；香菇多糖片，主要成分為香菇菌多糖，規(guī)格：基片重0.1g（浙江普洛康裕天然藥物有限公司，批號(hào)：20070401)；氫化可的松注射液（山西晉新雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：200704261)。生理鹽水（鄭州化學(xué)制藥廠，批號(hào)：070620021）；甲醛（上海化學(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站，批號(hào)：031208）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量18-21 g，6周齡，雌雄各半；由武漢生物制品檢定所提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：合格證號(hào)：0036893。實(shí)驗(yàn)室溫度20-25℃，濕度50%-60%，動(dòng)物自由飲食。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

EDTA抗凝管；JY601電子稱（上海民橋醫(yī)療器械有限公司）；TDL-40B型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；可調(diào)式移液器（上海雷勃分析儀器有限公司）；病理圖文分析系統(tǒng)（浙江永安公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BECKMAN COULTER公司，型號(hào)：EPICSXL）；組織切片機(jī)（德國(guó)蔡司公司，型號(hào)：Zeiss-HM440E）；電腦全自動(dòng)染色機(jī)（常州華利公司，型號(hào)：ZMN-20802）；電腦自動(dòng)組織脫水機(jī)（浙江科迪公司，型號(hào)：KD-TS3）；生物顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號(hào)：OLYMPUS BX-60）；高壓鍋或電爐或醫(yī)用微波爐；恒溫水浴鍋（北京市光明儀器廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)免疫抑制小鼠外周血T淋巴細(xì)胞水平的影響

取小鼠60只，采用完全隨機(jī)分組法均勻分成6組，其中5組使用氫化可的松造免疫抑制小鼠模型[7,8]。在給藥的前6天，每天均皮下注射50 mg·kg-1的氫化可的松注射液（濃度：2.5 mg·mL-1，給藥量：0.1 mL/10 g，分上午、下午兩次皮下注射給藥，每天總用量為50 mg·kg-1）。造模第1天，造模5組分別灌服高、中、低劑量的扶正排毒片混懸液（濃度：0.14、0.07、0.035 g·mL-1，給藥量：0.2 mL/10 g）、香菇多糖片混懸液（濃度：0.01 g·mL-1，給藥量：0.2 mL/10 g）及同體積的生理鹽水。空白對(duì)照組小鼠予同體積生理鹽水灌胃，不造模。每天給藥1次，連續(xù)給藥7天。第7天給藥后1 h，摘眼球取血，加EDTA抗凝，抗凝全血用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞水平。

1.2.2 對(duì)免疫抑制小鼠免疫器官的影響

摘眼球取血后的小鼠，脫頸椎處死，解剖后取胸腺、脾臟、小腸，使用10%甲醛溶液固定，做病理切片。結(jié)果見表2-表4。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料組間比較采用單因素方差分析，等級(jí)資料采用Ridit分析；P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 扶正排毒片對(duì)氫化可的松所致免疫抑制小鼠外周血T淋巴細(xì)胞水平的影響

從表1可以看出，與空白組比較，模型組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+極顯著下降（P＜0.01），說(shuō)明氫化可的松致小鼠免疫抑制模型成功建立。與模型組比較，香菇多糖片組及扶正排毒片高、中、低劑量組均可顯著提高免疫抑制小鼠CD3+、CD4+細(xì)胞數(shù)量（P＜0.01），促進(jìn)CD4+/CD8+比值增高（P＜0.01），詳見表1。

表1 扶正排毒片對(duì)氫化可的松所致免疫抑制小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的比較（n=10）

2.2 扶正排毒片對(duì)氫化可的松所致免疫抑制小鼠免 疫器官的影響

空白組脾臟中脾小結(jié)及淋巴細(xì)胞較為密集（圖1）。從表2可見，與空白組比較，模型組動(dòng)物的脾小結(jié)明顯縮小，淋巴細(xì)胞比較稀疏（P＜0.01），認(rèn)為成功建模。與模型組比較，香菇多糖片組及扶正排毒片高、中劑量組均可顯著改善免疫抑制小鼠脾小結(jié)縮小及淋巴細(xì)胞減少（P＜0.01），提示扶正排毒片對(duì)氫化可的松所致免疫抑制小鼠免疫功能具有改善作用。

從圖2可以看出，空白組動(dòng)物胸腺小葉分界清楚，皮質(zhì)與髓質(zhì)間分界清晰，皮質(zhì)淋巴細(xì)胞比較密集。從表3可見，與空白組對(duì)比，模型組動(dòng)物的胸腺皮質(zhì)明顯變薄，淋巴細(xì)胞亦較為稀疏（P＜0.01），我們認(rèn)為造模成功。與模型組對(duì)比，香菇多糖片組及扶正排毒片高、中劑量組均可顯著改善免疫抑制動(dòng)物模型小鼠胸腺皮質(zhì)萎縮及淋巴細(xì)胞稀疏（P＜0.01）。說(shuō)明扶正排毒片對(duì)氫化可的松所致免疫抑制小鼠免疫功能具有調(diào)節(jié)作用。

圖1 扶正排毒片對(duì)氫化可的松致免疫抑制小鼠脾臟組織形態(tài)的影響

表2 扶正排毒片對(duì)氫化可的松致免疫抑制小鼠脾臟組織中脾小結(jié)大小和淋巴細(xì)胞數(shù)的影響（n=10）

空白組動(dòng)物腸粘膜上皮細(xì)胞、粘膜固有層、粘膜下層、肌層和漿膜層均正常（圖3）。從表4可以看出，與空白組比較，模型組動(dòng)物腸粘膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯的變性壞死現(xiàn)象、粘膜固有層、粘膜下層均出現(xiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，經(jīng)Ridit檢驗(yàn)，P＜0.01，說(shuō)明造模成功。與模型組比較，扶正排毒片高、中劑量組均可顯著改善免疫抑制小鼠小腸炎癥反應(yīng)，經(jīng)Ridit檢驗(yàn)，P＜0.01，扶正排毒片低劑量組和香菇多糖片組有改善腸粘膜損傷的趨勢(shì)，提示扶正排毒片對(duì)氫化可的松所致免疫抑制小鼠免疫功能具有改善作用。

圖2 扶正排毒片對(duì)氫化可的松致免疫抑制小鼠胸腺組織形態(tài)的影響

表3 扶正排毒片對(duì)氫化可的松致免疫抑制小鼠 胸腺組織中胸腺厚度和淋巴細(xì)胞數(shù)的影響（n=10）

3 討論

中醫(yī)沒有艾滋病這一病名，但是中醫(yī)學(xué)對(duì)病毒性傳染病的研究和施治已有幾千年的歷史。根據(jù)發(fā)病過(guò)程和臨床特征，艾滋病應(yīng)屬于中醫(yī)“疫病”、“伏氣溫病”、“虛勞”、“五勞損傷”等范疇，也就是由慢性傳染病向內(nèi)傷雜病演變的疾病[9-12]。AIDS的主要病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)，疫毒之邪和瘀血內(nèi)結(jié)是標(biāo)，腎精虧損氣血不足是本，病位在肺脾腎。中醫(yī)中藥對(duì)AIDS治療既有抗病毒、抗機(jī)會(huì)感染的作用，也可提高機(jī)體免疫力和機(jī)體抗病毒能力和抵抗力，這正是目前治療AIDS的幾個(gè)重要方面。

圖3 扶正排毒片對(duì)氫化可的松致免疫抑制小鼠小腸組織形態(tài)的影響

扶正排毒片是河南中醫(yī)學(xué)院研制的治療艾滋病的中藥復(fù)方，由西洋參、黃芪、紫草、連翹、白花蛇舌草、甘草等組成，主要用于無(wú)癥狀HIV感染者。中醫(yī)理論認(rèn)為艾滋病基本病機(jī)為正氣不足、邪毒內(nèi)伏，常見的癥狀有乏力、氣短、納差、便溏、自汗、盜汗、易感外邪、頭暈、倦怠等，因此調(diào)補(bǔ)正氣，攻邪祛毒是其主要治則。

氫化可的松是一種糖皮質(zhì)激素的長(zhǎng)效制劑,對(duì)機(jī)體免疫過(guò)程中的許多環(huán)節(jié)均有抑制作用。小鼠在注射氫化可的松3天后出現(xiàn)活動(dòng)減少、精神狀態(tài)差、體質(zhì)量減輕等狀況，解剖后可觀察到小鼠的胸腺、脾臟等免疫器官出現(xiàn)明顯縮小，與正常組小鼠區(qū)別明顯。模型組小鼠胸腺的組織切片表明胸腺發(fā)生嚴(yán)重萎縮，細(xì)胞稀疏，皮質(zhì)明顯變薄，脾小節(jié)明顯縮小，淋巴細(xì)胞數(shù)明顯減少，淋巴小結(jié)和紅髓廣泛出現(xiàn)灶狀纖維增生，可以認(rèn)為模型組動(dòng)物的免疫功能顯著下降，免疫抑制小鼠模型造模成功。

表4 扶正排毒片對(duì)氫化可的松致免疫抑制小鼠小腸粘膜病理改變的影響（n=10）

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，扶正排毒片對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能有一定的調(diào)節(jié)作用，可以明顯改善免疫低下動(dòng)物蜷縮弓背、毛豎閉目、體重減輕等一般體征。通過(guò)光鏡病理觀察分析表明：扶正排毒片可以明顯改善免疫抑制小鼠脾臟脾小結(jié)縮小淋巴細(xì)胞稀疏，改善胸腺皮質(zhì)萎縮淋巴細(xì)胞稀疏，減少小腸粘膜炎癥浸潤(rùn)甚至壞死等病理改變。認(rèn)為扶正排毒片有調(diào)節(jié)免疫抑制動(dòng)物機(jī)體免疫功能的作用，有利于免疫功能低下小鼠免疫功能的恢復(fù)，改善生存質(zhì)量的作用，為扶正排毒片用于不適合抗病毒治療的HIV感染者的早期治療奠定一定基礎(chǔ)。

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Immunoregulatory Effects of Fuzheng Paidu Tablets on T Lymphocytes and Immune Organs in Mice

Shi Jingjing, Shi Bo, Miao Mingsan, Li Qingya
(College of Pharmacy, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China)

The goal of this study was to observe the impacts ofFuzheng Paidutablets (FZPDT) on blood cell immune function and pathological changes in immune organs, and to elucidate the immune regulation activity and mechanism of FZPDT in immunosuppressive mice. In this study, immunosuppressive model were establishedby subcutaneous injection with hydrocortisone. Mice were administered by intragastric infusion with high-, middle- and low-dose of FZPDT solution. Then the contents of CD3+, CD4+, CD8+T cells and ratio of CD4+to CD8+of all experimental animals were detected, and pathological changes in thymus, spleen and small intestine were observed. It was found that CD3+and CD4+cell counts and the ratio of CD4+to CD8+were increased in all the three doses of FZPDT groups and the lentinan tablet group when compared with the model group, which suggested that FZPDT may improve blood cell immune function in hydrocortisone-induced immunosuppressive mice.

Fuzheng Paidutablets, immunological function, hydrocortisone

10.11842/wst.2016.03.020

R285

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷 張志華，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2015-08-27

修回日期：2016-01-25

＊ 河南省科技廳基礎(chǔ)與前沿課題項(xiàng)目（102300413212）：HIV感染進(jìn)程中免疫調(diào)控分子動(dòng)態(tài)變化及中藥作用機(jī)制研究，負(fù)責(zé)人：李青雅；河南省人力資源和社會(huì)保障廳博士后基金（豫人社博管[2014]3號(hào)）：中藥扶正排毒片對(duì)艾滋病無(wú)癥狀HIV感染期的臨床研究，負(fù)責(zé)人：李青雅。

＊＊ 通訊作者：時(shí)博，講師，主要研究方向：中藥學(xué)研究。