連二亞硫酸鈉誘導SY5Y細胞缺糖缺氧模型及澤瀉白術藥對的作用觀察＊

劉莉娜，王紅梅，周建明，孟兆青，許治良，周 軍，王振中，蕭 偉

（1.江蘇康緣藥業股份有限公司 連云港 222001；2.中藥制藥過程新技術國家重點實驗室 連云港 222001）

連二亞硫酸鈉誘導SY5Y細胞缺糖缺氧模型及澤瀉白術藥對的作用觀察＊

劉莉娜，王紅梅，周建明，孟兆青，許治良，周 軍，王振中，蕭 偉＊＊

（1.江蘇康緣藥業股份有限公司 連云港 222001；2.中藥制藥過程新技術國家重點實驗室 連云港 222001）

目的：建立連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）誘導SH-SY5Y神經細胞缺氧缺糖損傷模型，進行提取物篩選，對篩選出的有活性提取物初步探討其對神經細胞的保護作用。方法：CCK-8檢測細胞存活率，比色法檢測乳酸脫氫酶（LDH）釋放，超氧化歧化酶活性（SOD），丙二醛含量（MDA），熒光探針負載法檢測細胞內活性氧（ROS）和細胞內鈣離子（[Ca2+]i）熒光強度。結果：連二亞硫酸鈉誘導SH-SY5Y細胞損傷模型上進行提取物初篩，發現澤瀉白術藥對提取物有一定活性。與模型組比較，提取物組細胞的LDH釋放降低，SOD活性升高，MDA含量降低，細胞內ROS水平和[Ca2+]i熒光強度均減弱。結論：澤瀉白術藥對提取物對連二亞硫酸鈉致SH-SY5Y神經細胞損傷有一定的腦保護作用。

SH-SY5Y細胞 缺氧缺糖 腦保護

根據WTO統計，全球腦血管疾病已成為當代第二大致死率的疾病。目前，對缺血引起的腦損傷，尚無有效治療藥物。因此，世界各國都在尋找有效的腦血管保護藥物?，F有研究表明，多種病理過程參與了腦缺血后的組織損傷，包括自由基、鈣超載、興奮性氨基酸、缺血半暗帶代謝障礙、細胞凋亡、炎癥以及新型的神經營養和組胺受體激動劑等[1]。國內學者研究發現，多種中藥提取物及中藥復方制劑表現出抗腦缺血作用的機制主要涉及上述幾個方面[2]。

目前在抗腦缺血化合物篩選研究中，雖然整體動物病理模型較接近腦缺血疾病狀態，但由于動物的個體差異較大，動物模型的制備有一定難度，對于大量化合物的篩選來說成本高、效率低，而利用離體細胞損傷模型則在一定程度上克服了這些缺點[3]。連二亞硫酸鈉誘導SH-SY5Y神經細胞損傷模型比較常見，是國內各大藥物篩選中心的常用模型[4]。本研究在此基礎上優化了該模型，通過篩選得到有活性的細胞提取物，并對其進行了表征。

1 材料

1.1 儀器與設備

SW-CJ-2F超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），Thermo 3100二氧化碳培養箱（美國Thermo公司），CKX41SF倒置顯微鏡（日本OLYPUS公司），96孔細胞培養板（美國Costar公司），75 cm2細胞培養瓶（美國Costar公司），Infinite M200 PRO酶標儀（瑞士Tacan公司），移液槍（德國eppendorf公司），BXM-30R立式壓力蒸氣滅菌鍋，LD4-2A離心機（北京眾益中和生物技術有限公司），c1028細胞自動計數儀（美國Invitrogen公司），ArrayScan高內涵檢測儀（美國Thermo公司）。

1.2 試劑

RPMI-1640培養基、無糖RPMI-1640培養基、胎牛血清（美國Gibco公司，批號分別為：8113041、124813、608759），胰蛋白酶（北京博奧拓達科技有限公司，批號：BH01018），尼莫地平（中國藥品生物制品檢定所，批號：00270-200002），DMSO（美國Sigma公司，批號：RNBC6511），連二亞硫酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：T20101206），CCK-8細胞毒性檢測試劑盒（上海貝博生物有限公司，批號：BB130041），乳酸脫氫酶檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所，批號：C0016），脂質氧化檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所，批號：S0131），總SOD活性檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所，批號：S0101），Hoechst33258（美國Sigma公司，批號：MKBC2653V），DCFH-DA（美國Sigma公司，批號：122M400V），Fluo-3/AM熒光探針（美國Sigma公司，批號：BCBG8147V）；SH-SY5Y人神經母細胞瘤細胞株購于中國科學院典型培養物保藏中心上海細胞庫。

2 方法

2.1 樣品的制備

澤瀉Alismatis Rhizoma，白術Atractylodis Macrocephalae Rhizoma經江蘇康緣藥業股份有限公司高級工程師王振中鑒定符合中國藥典規定。

稱取藥材共300 g，置于5 L燒瓶中，加入10倍量飲用水浸泡1 h后，加熱回流2 h，藥渣中加入8倍量的飲用水，加熱回流1 h，合并兩次提取液，過濾后上HP20型大孔樹脂（500 mL樹脂），上樣流速1 BV·h-1。用4 BV純水沖洗柱子，洗脫流速1.5 BV·h-1，再依次用20%、40%、95%乙醇洗脫（各4 BV，流速1.5 BV），收集各段洗脫液，分別于70℃下減壓濃縮至小體積，冷凍干燥既得樣品，每個部位得率基本在1%左右。

精確稱取樣品溶于DMSO中，使其終濃度為50 mg·mL-1。

2.2 細胞培養與給藥

細胞以1×105個/mL的密度接種于96孔細胞培養板，每孔100 μL，于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h，吸棄上清，按照實驗要求分為空白組、模型組、陽性藥組、提取物組。空白組給予完全培養基100 μL，其余各組給予100 μL含終濃度為4 mmol·L-1的連二亞硫酸鈉的無血清無糖培養基100 μL。缺氧缺糖一定時間，PBS清洗細胞孔一次，空白組和模型組給予完全培養基100 μL，給藥組給予完全培養基配制的終濃度為20 μmol·L-1的尼莫地平溶液和中藥提取物溶液100 μL。復氧一定時間后，進行細胞活性、乳酸脫氫酶（LDH）釋放，脂質氧化（MDA）、總SOD活性、活性氧（ROS）和細胞內鈣離子（[Ca2+]i）熒光強度測定。

2.3 測定CCK-8

各孔加入CCK-8溶液10 μL，同時設置空白孔（培養基和CCK-8，無細胞）和對照孔（不加培養基和CCK-8，有細胞）。37℃孵育4 h后，酶標儀在450 nm下測定吸光度。

2.4 測定LDH釋放量

各孔液體體積增加到200 μL。每組設三個復孔。復氧3 h后，將細胞培養板400 g離心5 min，分別取各孔的上清液120 μL，加入到新的96孔板相應孔中。各孔分別加入60 μL乳酸脫氫酶（LDH）溶液，混勻，室溫避光孵育30 min，490 nm處測定吸光度。

2.5 測定脂質氧化情況（MDA）

細胞培養和給藥在24孔板中進行，每組設三個復孔。棄上清，PBS清洗一次，細胞裂解液處理細胞，裂解后，1 600 g離心10 min取上清。設置檢測反應體系，混勻，100℃加熱15 min，冷卻后1 000 g離心10 min，取200 μL上清加入96孔板中，酶標儀在532 nm處測定吸光度。

2.6 測定總SOD活性

細胞培養和給藥在24孔板中進行，每組設三個復孔。棄上清，PBS清洗一次，細胞裂解液處理細胞，裂解后，1 600 g離心10 min取上清。按照說明書進行樣品測定，37℃孵育20 min，在450 nm下測定吸光度。

2.7 測定細胞內活性氧（ROS）

PBS清洗細胞孔一次，各孔加入含DCFHDA熒光探針（10 nmol·L-1）和Hoechst 33258（2 μmol·L-1）的PBS液100 μL，37℃暗處孵育20 min后，高內涵檢測儀通道1、通道2進行熒光檢測。

2.8 測定細胞內鈣離子（[Ca2+]i）

棄去上清，每孔加入含Fluo-3/AM（5 μmol·L-1）的BSS液100 μL，37℃暗處孵育40 min。棄上清，HBSS-BSA液清洗細胞孔一次，每孔加入含Hoechst33258（2 μmol·L-1）的BSS-BSA液100 μL，暗處孵育30 min后，高內涵檢測儀通道1、通道2進行熒光檢測。

3 結果

3.1 篩選模型的建立與優化

3.1.1 缺氧復氧時間

細胞以1×105個/mL的密度接種于96孔細胞培養板，每孔100 μL，于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h，模型組加入5 mmol·L-1連二亞硫酸鈉分別損傷1、2、3、3、4 h，棄上清，PBS清洗細胞孔一次，加入完全培養基相應復氧3、2、1、2、1 h后進行活力檢測，發現細胞在缺氧1 h、復氧3 h后損傷較大，故選擇此時間點。見圖1B。

3.1.2 缺氧劑濃度

細胞以1×105個/mL的密度接種于96孔細胞培養板，每孔100 μL，于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h后，分別加入0、1、2、4、8、12 mmol·L-1的連二亞硫酸鈉進行損傷1 h，棄上清，PBS清洗細胞孔一次，加入完全培養3 h后進行活力檢測。當濃度為2 mmol·L-1時，模型組有細胞固縮成圓形，其存活率和空白對照組已經有顯著性差異，為了不使細胞損傷過度，選擇4 mmol·L-1濃度進行缺氧損傷。見圖1A。

3.1.3 細胞密度

細胞以3×104個/mL、5×104個/mL、10×104個/mL、15×104個/mL、20×104個/mL密度接種于96孔細胞培養板，每孔100 μL，于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h，模型組加入4 mmol·L-1連二亞硫酸鈉損傷1 h后棄上清，PBS清洗細胞孔一次，加入完全培養基3 h后測定細胞活力。細胞接種密度為10×104個/mL時，細胞損傷顯著，故選擇此濃度。見圖1C。

3.1.4 藥物孵育時間

圖1 篩選模型的優化

細胞以1×105個/mL密度接種于96孔細胞培養板，每孔100 μL，于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h，模型組和陽性藥組加入4 mmol·L-1連二亞硫酸鈉損傷1 h，棄上清，PBS清洗細胞孔一次，空白組和模型組給予完全培養基100 μL，陽性藥組給予完全培養基配制的終濃度為20 μmol·L-1的尼莫地平溶液100 μL，復氧0.5、1、2、3、4 h后測定細胞活力。結果顯示，尼莫地平復氧孵育3 h時能顯著提高細胞存活率。見圖1D。

3.2 篩選方法的評估

Z′因子法是評估高通量篩選模型的重要方法，為檢測該模型是否適合高通量篩選要求，本研究對篩選模型的Z′因子進行了測定：隨機選取96孔板的60個孔，其中30個孔為陰性對照（細胞不加缺氧劑），30個孔造模，4 h后檢測細胞活力。利用公式一下計算：

其中，μ+為空白對照組平均值，μ-為模型組平均值，σ+為空白組標準偏差，σ-為模型組平均值。通過計算可知，Z′=0.76，CV為4.8%和7.2%，這說明該模型穩定。

隨機選取96孔板的60個孔進行缺氧損傷1 h，棄上清，PBS清洗細胞孔一次，其中30個孔加入20 μmol·L-1的尼莫地平溶液，30個孔加入完全培養基作為陰性對照，4 h后檢測細胞活力。利用上述公式計算，其中μ+為陽性藥組平均值，μ-為模型組平均值，σ+為陽性藥組標準偏差，σ-為模型組平均值，得到結果為Z′=0.79，CV為3.7%和4.6%，這說明該篩選模型適合高通量藥物篩選的要求。

3.3 藥物篩選

進行藥物篩選時，用含9%FBS的RPMI-1640培養基（缺氧時用不含血清的無糖RPMI-1640培養基），細胞以1×105個/mL密度接種于96孔細胞培養板，每孔100 μL，于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h，空白組加入完全培養基，其余各組加入4 mmol·L-1連二亞硫酸鈉損傷1 h，棄上清，PBS清洗細胞孔一次，空白組和模型組給予完全培養基100 μL，給藥組給予完全培養基配制的終濃度為20 μmol·L-1的尼莫地平和中藥提取物（DMSO濃度為1‰）100 μL，復氧3 h后測定細胞活力，每組設3個復孔。如果樣品的平均活性＞M+3SD，則可認為可能是有活性的。

利用優化后的方法提取物進行藥物篩選，發現了一些提取物有活性。

3.4 篩中物活性的進一步表征

為了進一步驗證篩中物的活性，本研究對澤瀉白術藥對提取物進行了活性表征，結果發現：澤瀉白術藥對提取物具有很好的抗連二亞硫酸鈉誘導缺氧缺糖的SH-SY5Y細胞損傷的活性。

3.4.1 抑制乳酸脫氫酶的釋放

連二亞硫酸鈉誘導缺氧缺糖的SH-SY5Y細胞，乳酸脫氫酶（Lactic Dehydrogenase，LDH）釋放顯著增加，澤瀉白術藥對提取物能明顯抑制乳酸脫氫酶釋放，這說明該提取物能對連二亞硫酸鈉誘導缺氧缺糖損傷的SH-SY5Y細胞有良好的保護作用。見圖2。

3.4.2 抗氧化作用

連二亞硫酸鈉誘導缺氧缺糖的SH-SY5Y細胞，SOD活性顯著降低，MDA含量明顯增加，ROS水平顯著提高，澤瀉與白術藥對提取物能明顯降低MDA含量和ROS水平，提高SOD活性，這說明該提取物能對連二亞硫酸鈉誘導缺氧缺糖損傷的SH-SY5Y細胞有抗氧化作用。見圖3。

3.4.3 細胞內鈣離子的檢測

連二亞硫酸鈉誘導缺氧缺糖的SH-SY5Y細胞，細胞內鈣離子顯著增多，澤瀉與白術藥對提取物能明顯降低細胞內[Ca2+]i水平。見圖4。

圖2 澤瀉白術藥對提取物對細胞的LDH釋放量影響

圖3 澤瀉白術藥對提取物對細胞的抗氧化影響

4 討論

根據發病原因的不同，腦血管疾病可分為缺血性和出血性病變，前者具有發病率高、致殘率高和復發率高的特點。因此，對缺血性腦血管病的防治倍受社會關注，同時通過建立體外細胞損傷模型對組分進行活性篩選也成為研究熱點。本研究通過模型優化建立了細胞損傷模型，同時測定Z′因子大于0.5，由此證明此模型比較穩定，可以用來進行藥物篩選。

圖4 澤瀉白術藥對提取物對細胞內[Ca2+]i影響

高內涵篩選技術在藥物研發的初篩、機制研究和安全性評價方面具有重要作用，能將藥物對活細胞的作用進行圖像采集，通過軟件進行數據分析得到實驗結果[5]。本研究嘗試用不同的熒光探針對細胞進行染色，獲得相關數據[6、7]。實驗發現，細胞損傷過程中部分死亡，細胞數目減少，模型組總體熒光值較小；空白對照組細胞數目較多得到的總體熒光值較高，直接用酶標儀測定熒光強度不能正確反映ROS和鈣離子的水平。因此，本研究選擇高內涵儀器用Hoechst標記細胞核，通過數據輸出系統得到平均熒光值來考察提取物對細胞的相關影響[8]。

氧化應激可引起細胞死亡，活性氧作為第二信使在許多信號通路中扮演著重要角色，比如AKT途徑、線粒體介導的caspase凋亡途徑等[9]。SOD能清除自由基，MDA水平變化可以間接反映體內自由基的生成，三者能作為抗 氧化的指標。

鈣離子超載是引起腦缺血的一大因素。細胞缺氧缺糖時，由于細胞線粒體功能障礙，細胞內[Ca2+]i水平明顯提高[10]。實驗中可以看到[Ca2+]i水平隨ROS水平的增加而增加，也有相關報道顯示兩者相互促進，影響細胞凋亡[11]。

中藥藥對是指中醫臨床相對固定的兩味藥組成的方劑，是中藥復方配伍中比較常見的形式。藥對配伍組合研究有助于剖析方劑配伍機理及其治療疾病的作用機制[12]。澤瀉白術藥對中的“澤瀉”可用于治療水腫脹滿、高血脂癥[13]。有報道稱澤瀉提取物是毒蕈膽堿M1受體激動劑，具有腦保護作用[14]。白術中的白術多糖能顯著地抑制缺氧復氧誘導的神經細胞早期凋亡[15]。

本研究發現連二亞硫酸鈉誘導SH-SY5Y細胞損傷后，澤瀉白術藥對提取物對該損傷細胞有一定的保護作用，這可能與其抗氧化應激作用和改善鈣離子超載有關，澤瀉白術提取物中發揮作用的物質基礎，還有待進一步研究。

1 Theodore Kalogeris, Christopher P. Baines, Maike Krenzet al. Cell Biology of Ischemia/Reperfusion Injury.Int Rev Cell Mol Biol, 2012 (298): 229-317.

2 高梅,杜冠華.抗腦缺血藥物的研究現狀與進展.中國醫藥導刊, 2006, 8(5): 323-325.

3 王春梅,喬延江.細胞模型發展現狀及應用于中藥研究的探討.世界科學技術-中醫藥現代化, 2004, 6(3): 29-32.

4 劉瑞凝,王偉,謝偉東,等.雪白睡蓮花中黃酮類成分抗氧化及擬缺血對神經細胞作用的研究.世界科學技術-中醫藥現代化, 2006, 8(5): 33-36.

5 王萌萌,何玲,胡梅,等.高內涵篩選技術及其在藥學研究中的應用.藥學進展, 2011, 35(11): 481-486.

6 張曉,張國慶,顧伯林,等.丹參對人成骨細胞骨鈣素生成及鈣離子濃度的影響.世界科學技術-中醫藥現代化, 2013, 15(2): 89-91.

7 秦勇.細胞內ROS水平改變對細胞活性及相關信號傳導途徑的影響.杭州:浙江大學博士學位論文, 2012.

8 Mouchet E H, Simpson P B. High-content assays in oncology drug discovery: opportunities and challenges.IDrugs, 2008, 11(6): 422-427.

9 周映彤,肖洪彬,畢明剛.活性氧與內質網應激.中國藥理學通報, 2011, 27(5): 597-600.

10 Wang C, Nguyen H N, Maguire J L,et al. Role of Intracellular Calcium Stores in Cell Death From Oxygen-Glucose Deprivation in a Neuronal Cell Line.J Cerebral Blood Flow & Metabolism, 2002, 22: 206-214.

11 Lewen A, Matz P, Chan P H. Free radical pathways in CNS injury.J Neurotrauma, 2000, 17(10): 871-890.

12 王勝鵬,陳美婉,王一濤.中藥藥對的系統研究(Ⅰ)-理論與物質基礎研究.世界科學技術-中醫藥現代化, 2012, 14(2): 1317-1321.

13 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部).北京:化學工業出版社. 2010: 212.

14 高虹,胡應和.用毒蕈膽堿M1受體激動劑篩選技術發現的澤瀉的新用途.中國, CN1615981, 2005-05-18.

15 胡微煦,向勤,付愛珍,等.白術多糖對神經細胞毒性及抗缺氧誘導的神經細胞凋亡的影響.中藥藥理與臨床, 2014, 30(3): 89-91.

Drug Screening against Damage of Na2S2O4induced SH-SY5Y Cells by Oxygen-glucose Deprivation and Effect of Herb Pair of Zexie-Baizhu

Liu Lina, Wang Hongmei, Zhou Jianming, Meng Zhaoqing, Xu Zhiliang, Zhou Jun, Wang Zhenzhong, Xiao Wei
(1. Jiangsu Kanion Pharmaceutical, Ltd., Lianyungang 222001, China; 2. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001 China)

This study was aimed to establish the Na2S2O4induced SH-SY5Y cell in order to screen model for the research of effective extractions of herb pairs and its related mechanism. CCK-8 was used to detect cell survival rate. Colorimetric method was used to detect the releasing of lactate dehydrogenase (LDH), superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA). Fluorescence probe method was used to detect the fluorescence intensity of reactive oxygen species (ROS) and intracellular calcium concentration ([Ca2+]i). The results showed that the extract screened with Na2S2O4induced SH-SY5Y cell indicated that herb pair ofZexie-Baizhuhad certain activity on the extract. Compared to the model group, the releasing of LDH decreased, SOD activity increased, the content of MDA decreased, and the fluorescence intensity of ROS and [Ca2+]i decreased in the extract group. It was concluded that herb pair ofZexie-Baizhuhad certain cerebral protective effects on Na2S2O4induced SHSY5Y cell.

SH-SY5Y cell, oxygen-glucose deprivation, cerebral protection

10.11842/wst.2016.03.021

R285.5

A

（責任編輯：馬雅靜 張志華，責任譯審：王 晶）

2014-12-31

修回日期：2015-02-27

＊ 科學技術部國家科技重大專項“重大新藥創制”項目（2013ZX09402203）：現代中藥創新集群與數字制藥技術平臺，負責人：王振中。

＊＊ 通訊作者：蕭偉，本刊編委，博士，研究員級高級工程師，主要研究方向：中藥新藥的研究與開發。