發酵期慕薩萊思中乳酸菌的分離及表型鑒定

高 榮　陳春楊　張秀萍

(塔里木大學動物科學學院， 新疆 阿拉爾 843300)

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發酵期慕薩萊思中乳酸菌的分離及表型鑒定

高 榮陳春楊張秀萍*

(塔里木大學動物科學學院， 新疆 阿拉爾 843300)

摘要為了解處于發酵期的慕薩萊思中乳酸菌(LAB)種類，對第10，20天的發酵液中乳酸菌進行分離并鑒定。采用平板菌落計數法計算發酵液中的乳酸菌總數，選擇性培養基MRS、M17對慕薩萊思發酵液中的乳酸菌桿菌和球菌進行篩選，然后對分離株革蘭氏染色后顯微鏡鏡檢觀察菌體形態，生理生化生物學特性試驗等方法鑒定屬種。結果，此次樣品第10,20天發酵液中的乳酸菌數量分別是3.9×105 cfu/ml，5.0×105 cfu/ml；得到7種乳酸菌，分別是德氏乳桿菌德氏亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳桿菌干酪亞種(Lactobacillus casei cheese subsp.casei)、酒酒球菌(Oenococcus oeni)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、糊精片球菌(Pediococcus dextrinicus)，它們是此次慕薩萊思樣品處于發酵期微生態環境中的部分組成成分。

關鍵詞乳酸菌； 分離； 表型鑒定； 慕薩萊思

1引言

慕薩萊思是新疆特產，主產地在阿瓦提縣，是一種釀造的味美醇香的葡萄酒。葡萄酒中存在的細菌主要為乳酸菌 ,它們的存在對葡萄酒的品質會產生有利或有害的影響[1]：有益乳酸菌主要通過蘋果酸-乳酸發酵(MLF)、檸檬酸發酵、果糖和葡萄糖發酵,正常進行的MLF、檸檬酸發酵產物雙乙酰(2,3-丁二酮)及其衍生物(2,3-丁二醇)對葡萄酒具有改善口感，增香作用；有害乳酸菌通過分解殘糖和檸檬酸,增加葡萄酒的揮發酸度，使酒出現絲狀混濁，沉淀，產生異味物質，甚至高濃度的生物胺。目前對慕薩萊思發酵過程中乳酸菌的種類及作用研究報道的還很少，因此，本研究采用選擇性培養基對慕薩萊思發酵過程中的乳酸菌進行篩選，從形態與理化特征方面進行鑒定屬種，了解發酵階段慕薩萊思葡萄酒中乳酸菌的種類，為進一步探索乳酸菌影響慕薩萊思葡萄酒品質的機制提供材料。

2材料和方法

2.1材料

新疆阿克蘇地區阿瓦提縣刀郎酒廠發酵第10,20天的慕薩萊思發酵液各3瓶，500 ml/瓶。

培養基：MRS，M17，生化鑒定試劑購自青島海博生物技術有限公司。

厭氧產氣袋，購自北京陸橋技術股份有限公司。

2.2方法

2.2.1乳酸菌細菌總數計數

按平板菌落計數法[2]。吸取原液進行連續稀釋,將1:1 000，1:10 000，1:100 000稀釋度的稀釋液與MRS、M17瓊脂培養基混勻，置于37 ℃恒溫培養箱中厭氧培養48 h后計數。

2.2.2乳酸菌的分離

將原液、稀釋液接種于MRS、M17瓊脂固體培養基和液體培養基，于37 ℃恒溫培養箱中厭氧培養48 h～72 h，挑選形態有差異的單菌落劃線接種到MRS固體平板培養基進行純化。將分離到的革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的桿菌接種至MRS固體斜面，球菌接種到M17固體斜面，于4 ℃中保存備用。

2.2.3乳酸菌的鑒定

根據凌代文《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[3]及張剛《乳酸細菌:基礎、技術及應用》[4]中有關乳酸菌形態和生理生化特性進行相關試驗：菌落、菌體形態的觀察，運動性檢查，耐鹽性試驗(NaCl%:5%,18%)，耐酸性試驗(pH范圍3. 5、4. 5、5. 5、6. 5)，溫度試驗(10 ℃，45 ℃),葡萄糖酸鹽試驗，糖類發酵試驗(阿拉伯糖、半乳糖、乳糖、纖維二糖、果糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇、鼠李糖、甘露糖、山梨醇)。

3結果

3.1乳酸菌的計數

刀郎酒廠慕薩萊思發酵第10、20天乳酸菌數為3. 9×105cfu/ml，5. 0×105cfu/ml。

3.2乳酸菌的鑒定

分離獲得7株乳酸菌C1、C2、C3、Q1、Q2、Q3、Q4，依次為德氏乳桿菌德氏亞種、植物乳桿菌、干酪乳桿菌干酪亞種、酒酒球菌、藤黃微球菌、嗜熱鏈球菌、糊精片球菌。圖1為7株乳酸菌的形態特征，表1對分離到的乳酸菌的菌落、菌體形態特征進行了描述，表2記錄了7株乳酸菌的部分生化特性。

3株乳桿菌屬的細菌：德氏乳桿菌德氏亞種、植物乳桿菌、干酪乳桿菌干酪亞種。分離株德氏乳桿菌德氏亞種，利用葡萄糖產酸不產氣，可以發酵葡萄糖酸鹽，也可以發酵纖維二糖、果糖、蔗糖、海藻糖，不能利用其它碳水化合物。植物乳桿菌發酵葡萄糖產酸不產氣，發酵葡萄糖酸鹽，纖維二糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖，不發酵鼠李糖。干酪乳桿菌干酪亞種從葡萄糖產酸不產氣，發酵葡萄糖酸鹽，半乳糖，果糖等單糖，也能發酵蔗糖，纖維二糖等雙糖，不能發酵鼠李糖。

4株乳酸球菌屬的細菌：酒酒球菌、藤黃微球菌、嗜熱鏈球菌、糊精片球菌。分離株酒酒球菌，細菌鏈狀排列，從葡萄糖產酸產氣，發酵葡萄糖酸鹽、葡萄糖、果糖、蔗糖，不運動，pH3. 5～6. 5環境中都可以生長。藤黃微球菌，球形密集排列，接觸酶陽性，不分解葡萄糖，發酵葡萄糖酸鹽，能在5%NaCl中生長，不運動。嗜熱鏈球菌細胞鏈狀排列，從葡萄糖產酸不產氣，發酵葡萄糖酸鹽、乳糖、纖維二糖，不可發酵甘露醇，山梨醇，在10℃不生長而在45℃生長，可以運動。糊精片球菌，四聯狀，可利用葡萄糖產酸不產氣，發酵葡萄糖酸鹽、蔗糖，半乳糖，甘露糖，不發酵海藻糖，甘露醇，鼠李糖，不能生長于18%NaCl中，不運動。

圖1　7株乳酸菌的形態特征

注：依次為C1德氏乳桿菌德氏亞種、C2植物乳桿菌、C3干酪乳桿菌干酪亞種、Q1酒酒球菌、Q2藤黃微球菌、Q3嗜熱鏈球菌、Q4糊精片球菌,革蘭氏染色，100×10。

表1　7株乳酸菌的菌落、菌體形態特征

表2　7株乳酸菌的部分生化特性鑒定結果

續上表

試驗項目C1C2C3Q1Q2Q3Q4海藻糖++++++-甘露醇-++----鼠李糖-------甘露糖+++++++山梨醇--+++-+

4討論與結論

在良好的條件下，葡萄酒釀造過程乳酸菌的生長周期包括3個主要階段：(1)潛伏階段，此階段乳酸菌群體數量下降，但保留下最適應葡萄酒環境的自然選擇群體；(2)繁殖階段，出現在酒精發酵結束后，乳酸菌迅速繁殖并使其群體數量達到最大值；(3)平衡階段：乳酸菌群體數量幾乎處于平衡、穩定狀態。在適宜的條件下，該階段可持續很長時間。本實驗樣品中第10，20天的乳酸菌數分別是3. 9×105cfu/ml，5. 0×105cfu/ml，說明乳酸菌群體數量變化很小，進入平衡階段，推測該樣品慕薩萊思發酵第10～20天期間可能是MLF發酵的第3階段。

從發酵食品中不斷獲得到多株具有MLF良性發酵且較高抗氧化活性的乳酸菌，使得乳酸菌日益成為研究的熱點。研究表明片球菌，植物乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種等乳酸菌不僅可以改善葡萄酒的口感和風味，還可以增強葡萄酒的抗氧化性，抑制病原體的生長,清除自由基[5,6,7]。嗜熱鏈球菌產生的乳酸鏈球菌素是天然的防腐劑，糊精片球菌不僅可以作為促酵劑物，而且有些可以降低發酵產物中的含胺量。同時，多數研究認為酒類酒球菌、片球菌是葡萄酒發酵過程中的有害菌。此次在MLF發酵過程中分離到的7株乳酸菌對慕薩萊思品質走向將起到何種作用，尚待進一步研究。

綜上所述，本次研究得到了慕薩萊思發酵過程中的7種乳酸菌，它們是此次樣品微生態系統中的部分組成成分。

參考文獻

[1]權英，王頡，張偉.葡萄酒中的乳酸菌[J].釀酒科技.2002(2):59-62.

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[3]凌代文，東秀珠.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M].北京:中國輕工業出版社，1999:63-67.

[4]張剛.乳酸細菌:基礎、技術和應用[M].北京化學工業出版社,2007：129-134.

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[7]段浩云.田洪濤.檀建新，等.葡萄酒MLF高耐受性優良乳酸菌的篩選與鑒定[J].中國食品學報.2015,15(5):200-205.

Isolation and Phenotypic Identification of Lactic Acid Bacteria from Msalais Fermentation Liquor

Gao RongChen ChunyangZhang Xiuping*

(College of Animal Science, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300)

AbstractIn order to understand LAB(Lactic Acid Bacteria) from Msalais fermentation liquor, lactic acid bacteria were isolated and identified in from the 101hand 202hfermentation. Colony Counting Method was used to estimate the total number of LAB.Lactic acid bacteria and coccus were screened by selective culture medium MRS and M17 in Msalais fermentation liquid. Identificated the species Species of LAB were identificated through cell morphology observation after Gram's stain and tests of physiological and biochemical characteristics. The results show that the total number of LAB maintains about 3.9×105 cfu/ml and 5.0×105 cfu/ml on the 10th and 20th day. Seven species of LAB were collected, and they were Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei cheese subsp.casei, Oenococcus oeni, Micrococcus luteus, Streptococcus thermophilus, Pediococcus dextrinicu. They composed the micro-ecological environment of the Msalais fermentation liquor.

Key wordsLAB(Lactic Acid Bacteria)； isolation； phenotypic identification；Msalais

中圖分類號：TS201.3

文獻標識碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2016.02.002

文章編號：①1009-0568(2016)02-0008-04

作者簡介：高榮(1992-)，女，2015屆本科生，研究方向為發酵食品乳酸菌。E-mail：102323664@qq.com*為通訊作者E-mail：zxpdky@126.com

基金項目：塔里木大學動物科學學院大學生創新項目(DKY2013003)；塔里木大學校長基金項目(TDZKSS201403)。

收稿日期：①2015-05-08