長期慢性低氧對牦牛和黃牛血液中HIF-2α、EPO水平及紅細胞相關指標的影響

劉鳳云，李愈嫻，胡　琳，劉世明，祁生貴，楊　蕾，唐永平，吳天一

(青海省高原醫學科學研究院，科技部高原醫學研究重點實驗室培育基地，西寧　810012)

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長期慢性低氧對牦牛和黃牛血液中HIF-2α、EPO水平及紅細胞相關指標的影響

劉鳳云，李愈嫻，胡琳，劉世明，祁生貴，楊蕾，唐永平，吳天一

(青海省高原醫學科學研究院，科技部高原醫學研究重點實驗室培育基地，西寧810012)

摘要為探討牦牛和遷飼黃牛血液中紅細胞(RBC)、血紅蛋白(HB)、低氧誘導因子-2α(HIF-2α)、促紅細胞生成素(EPO)等因子對高原適應和習服的不同特征及調控機理，按照海拔低于3 500 m和高于3 500 m 兩組采集青海地區的牦牛血樣，同時采集高山遷飼黃牛(海拔2 500 m)及低海拔黃牛(海拔1 300 m)血液，采用全自動血液分析儀測定血液中紅細胞、血紅蛋白、紅細胞比容(HCT)、平均紅細胞血紅蛋白量(MCH)等；采用雙抗夾心酶標法測血液中EPO、HIF-2α含量。通過t檢驗及單因素方差分析法分析指標間的差異性，并分析各指標與HIF-2α、EPO的相關性。結果表明，海拔高于3 500 m牦牛組的RBC、HB、 HCT顯著升高，而HIF-2α和EPO水平卻未發生顯著變化。與遷飼黃牛和低海拔黃牛相比，牦牛血液中的RBC明顯降低，而MCH、HIF-2α和EPO顯著升高。牦牛血液中EPO、RBC、HB、HCT、MCH水平與HIF-2α水平呈顯著相關；遷飼黃牛血液中紅細胞分布寬度(RDW-SD)與EPO水平呈顯著相關；低海拔黃牛血液EPO、MCH水平與HIF-2α水平呈顯著相關。推測：海拔升高引起的低氧是影響牦牛血液RBC、HB、HCT改變的主要因素；與黃牛相比，低RBC、低MCH、高HIF-2α、高EPO水平是牦牛適應低氧的主要特征，且牦牛血細胞各指標對血液中HIF-2α水平的改變更敏感。提示牦牛通過遺傳進化成功適應高原環境。

關鍵詞慢性低氧；牦牛；高山遷飼黃牛；血細胞；HIF-2α；EPO

低氧(hypoxia)是影響青藏高原生命健康的重要因素。紅細胞和血紅蛋白在生物體內承擔運輸氧氣的生理功能，對低氧條件下保證組織細胞的氧氣供應及生物氧化有重要作用。促紅細胞生成素(Erythropoietin，EPO)主要在幼紅細胞未形成血紅蛋白時促進紅系增殖。有研究表明，低氧時，低氧誘導因子-2α(Hypoxia-inducible factor-2a，HIF-2α)是EPO生成的主要調控者[1-2]，與高原世居者和土生動物適應高原、維持低血紅蛋白濃度密切相關[3]。有關長期慢性低氧時牦牛血細胞適應特征的研究多有報道[4-7]，但不同海拔時紅細胞各參數水平與血液中HIF-2α和EPO水平的相關性尚不清楚。遷飼至高海拔的黃牛與牦牛均面臨低氧的挑戰，在習服高原的過程中高海拔黃牛血細胞與低海拔黃牛相比發生了哪些變化？此改變是否與高原適應的牦牛具有趨同性？與HIF-2α、EPO水平相關性如何？這些均未見報道。因此，本研究對長期慢性低氧時牦牛和黃牛血液中HIF-2α、EPO水平及紅細胞、血紅蛋白的相關生理指標進行分析，以探討牦牛對高原的適應(Adaptation)和平原遷飼高原黃牛的習服(Acclimatization)間的生物學特征及其相關性。這對高原人類適應及生物低氧進化也有借鑒意義。

1材料與方法

1.1動物與分組

牦牛組：按產地海拔不同，分低于3 500 m牦牛組及高于3 500 m牦牛組；高山遷飼黃牛組：為20世紀70年代末從山東引進的西門塔爾牛與當地黃牛的雜交品種，遷飼地海拔2 500 m；低海拔黃牛組：為甘肅省平涼市飼養的當地秦川牛，飼養地海拔1 300 m。 3種牛均為4～6歲的雄性牛。

1.2檢測方法與指標

牛頸動脈放血處死時收集血液，置于肝素抗凝管中于3 000 r/min離心10 min后吸出上清液，采用日本Sysmex公司生產的全自動血液分析儀(型號Sysmex XT-1800i)進行紅細胞計數(Red blood cell count，RBC)、血紅蛋白測定(Hemoglobin，HB)、紅細胞比容(Hematocrit， HCT)、平均紅細胞體積(Mean corpuscular volume，MCV)、平均紅細胞血紅蛋白量(Average red blood cell hemoglobin content，MCH)、紅細胞分布寬度-CV[Red blood cell distribution width (CV)，RDW-CV]、紅細胞分布寬度-SD[Red blood cell distribution width(SD)，RDW-SD]等與紅細胞相關的指標測定；采用雙抗體夾心法測定牛血標本中HIF-2α和EPO水平。ELISA試劑盒為上海將來實業有限公司產品，抗體均為兔多抗，采用美國BIO-RAD公司生產的EVOLIS全自動酶免分析系統進行檢測。

1.3數據處理

采用SPSS17.0軟件分析數據，其中，組間比較采用獨立樣本t檢驗及單因素方差分析，相關性檢驗采用雙側Pearson相關性檢驗。數據以“平均數±標準差”表示。

2結果與分析

2.1不同海拔牦牛血液中血細胞相關指標及HIF-2α和EPO的變化

獨立樣本t檢驗分析結果顯示(表1)，與生活在較低海拔的牦牛相比，生活在極高海拔牦牛的RBC、HB、 HCT及 RDW-CV 4項指標顯著升高， 且差異極顯著(P<0.01)，其他指標間無顯著性差異(P>0.05)。

表1　不同海拔牦牛血液中血細胞相關指標及HIF-2α和EPO的變化

注：RBC. 紅細胞計數；HB. 血紅蛋白；HCT. 紅細胞比容；MCV. 平均紅細胞體積；MCH. 平均紅細胞血紅蛋白量；RDW-CV. 紅細胞分布寬度(CV)；RDW-SD. 紅細胞分布寬度(SD)；HIF-2α. 低氧誘導因子-2a；EPO. 促紅細胞生成素。**表示與海拔低于3 500 m牦牛組比較，P<0.01。下同。

Note：RBC. Red blood cell count; HB. Hemoglobin; HCT. Hematocrit; MCV. Mean corpuscular volume; MCH. Average red blood cell hemoglobin content; RDW-CV. Red blood cell distribution width(CV); RDW-SD. Red blood cell distribution width (SD); HIF-2α. Hypoxia-inducible factor-2a; EPO. Erythropoietin. **Blow 3 500 m yak group versus over 3 500 m yak group,P<0.01.The same below.

2.2牦牛、遷飼黃牛及低海拔黃牛血液中血細胞相關指標及HIF-2α和EPO的變化

單因素方差分析結果顯示(表2)，牦牛血液中RBC、MCH、RDW-CV、HIF-2α、EPO與遷飼黃牛、低海拔黃牛有顯著性差異，黃牛之間無顯著性差異。其中，牦牛RBC、RDW-CV 顯著低于遷飼黃牛和低海拔黃牛，MCH、HIF-2α、EPO顯著高于遷飼黃牛和低海拔黃牛。

2.3牦牛、遷飼黃牛和低海拔黃牛血細胞指標與血液HIF-2α、EPO水平的相關性

雙側Pearson 相關性檢驗結果顯示(表3～表5)，牦牛血液中RBC、HB、HCT、MCV、MCH及RDW-SD與血液中HIF-2α水平呈顯著相關，與EPO水平無相關性，HIF-2α與EPO水平顯著相關；遷飼黃牛血液中RBC、HB、HCT、MCV、MCH及RDW-SD與血液中HIF-2α無相關性，而RDW-SD與EPO水平呈顯著相關，HIF-2α與EPO水平不相關；低海拔黃牛血液中RDW-CV和MCH與HIF-2α呈顯著相關，其他血細胞指標均與HIF-2α和EPO水平不相關，HIF-2α與EPO水平呈顯著相關。

表2　牦牛和黃牛血液中HIF-2α、EPO水平及紅細胞相關指標變化

注：牦牛與黃牛比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note：Yak versus cattle, *P<0.05, **P<0.01.

表3　牦牛血細胞指標與血液HIF-2α、EPO水平的相關性

注： * 在 0.05 水平(雙側)上顯著相關。** 在 0.01 水平(雙側)上顯著相關。下同。

Note：*significant correlation on 0.05 level; ** significant correlation on 0.01 level.The same below.

表4　遷飼黃牛血細胞指標與血液HIF-2α、EPO水平的相關性

表5　低海拔黃牛血細胞指標與血液HIF-2α、EPO水平的相關性

3討 論

因高原世居人群和高原土生動物的生活環境和生活習性不同，其紅細胞和血紅蛋白存在相同(趨同進化)或不同(適應輻射)的適應特征。本研究結果表明，生活在青藏高原較高海拔牦牛血液中RBC、HB、HCT 及RDW-CV等均顯著高于較低海拔牦牛。說明：隨著海拔的增加，氧分壓降低，牦牛血液中RBC、HB、HCT、RDW-CV會代償性增加以滿足機體對氧的需求。這與江家椿等[4]報道的生活在西藏那曲(海拔4 500 m)牦牛紅細胞總數、紅細胞壓積、血液總量、血紅蛋白均極明顯高于較低海拔的藏南河谷(海拔3 000 m)牦牛的結果一致。Wu等[3]對3 500名居住在喜馬拉雅高山居民(藏族、夏爾巴人和拉達克人)的平均血紅蛋白濃度進行分析，結果顯示，其平均血紅蛋白濃度均低于移居喜馬拉雅的低地居民(漢族、印度泰米爾人及前往珠穆朗瑪峰探險的歐洲平原人)和安第斯山脈的高原居民 ，揭示青藏高原世居居民在高原適應上的生理特征。而有研究顯示，高原鼠兔(Plateau pika，Ochotonacurizoniae)這一典型的高山土生動物是以低HCT、低HB為特征，不因海拔的變化而表現出明顯的RBC的變化[8]。

與高山遷飼黃牛和低海拔黃牛相比，雖然牦牛血液中RBC水平顯著低于黃牛，但其MCH顯著高于黃牛。說明：牦牛不是通過增加RBC值而是通過提高紅細胞的HB含量來適應高原，這樣既防止紅細胞增多導致血液粘稠度增高引發的循環功能障礙，又通過MCH的增高來攜帶更多的氧以滿足長期缺氧環境中機體的需要，這是牦牛適應高原的一個重要的血液學特征。

紅細胞體積分布寬度(RDW)是反映周圍血循環血液中紅細胞體積大小變異的參數，RDW增高提示紅細胞生成障礙或紅細胞破滅增加,在臨床上多用于不同類型貧血的鑒別診斷,也可預測包括原發性肺動脈高壓和慢性心臟衰竭在內的主要疾病的存活率[9-10]。牦牛血液中的RDW-CV值顯著低于黃牛，而高原遷飼黃牛和低海拔黃牛間無顯著差異。說明：長期慢性低氧時，牦牛血液中異常增生的紅細胞或破滅的紅細胞低于黃牛，這使得牦牛紅細胞體積更為均一，更利于紅細胞的變形以通過狹窄的毛細血管，這可能是牦牛適應高原的另一血液形態學特征，但尚需排除是否與牦牛和黃牛間的種屬差異有關。

有研究發現，大多數低氧誘導基因的低氧誘導途徑可通過HIF實現[11]，HIF-2α可主要調節EPO的生成[2]。分析高原土生牦牛和遷飼黃牛血液中HIF-2α和EPO的關系可以發現，隨海拔高度增加，牦牛血液中HIF-2α和EPO的水平未顯著性增加，而與遷飼至高海拔的黃牛和生活在低海拔的黃牛相比，牦牛血液中HIF-2α和EPO水平高出1.5～2.2倍。說明：一方面高原牦牛血液中EPO能有效調控低氧條件下紅細胞的生成，另一方面又能有效地使RBC及HB值處于一個穩態水平，這是牦牛適應高原的一個重要特征，也是高原牦牛和平原遷飼黃牛的血細胞應對高原低氧反應的主要區別。相關性分析表明，牦牛血液中HIF-2α與EPO水平呈顯著正相關。說明：盡管高原牦牛生活在低氧環境，但其血液中的HIF-2α與EPO已建立穩定的調控關系，與低海拔黃牛的相關性相似，這是高山土生動物最成功的遺傳-進化適應(genetic adaptation)的生物學標志，然而處于習服水平的遷飼黃牛則不具備此特征。

牦牛的HIF-2α與RBC、HB、HCT、MCV、MCH、RDW-SD均呈顯著正相關，與世居藏族居民血液中HIF-2α與HB呈正相關的報道一致[12]。說明：通過長期的自然選擇，高原世居人群和高山土生動物在面臨同樣的高原低氧環境時具有相似的生理-生物學適應策略。低海拔黃牛的HIF-2α與MCH、RDW-CV呈顯著相關，而高山遷飼黃牛的HIF-2α與檢測的血細胞指標均無明顯的相關性，僅RDW-SD與EPO呈顯著負相關，可能反應牦牛血液學對HIF-2α的調控更為易感，血細胞的RBC、HB、HCT、MCV、MCH、RDW-SD隨時隨著HIF-2α的改變而改變，而遷飼黃牛尚處于高原習服狀態，血細胞隨HIF-2α變化而改變的緊密聯系并未完全建立。有研究[13-15]認為，高原鼠兔適應低氧的模式是低代謝高應激的優秀模式，牦牛生存環境與高原鼠兔類似，這提示兩者可能存在趨同性進化，具體還有待進一步研究。

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Received 2015-07-23Returned2015-11-27

Foundation itemThe “pre-973” National Basic Research Program(No.2012CB722506); “973” National Basic Research Program(No.2012CB518202).

First authorLIU Fengyun, female, research fellow. Research area:hypoxic physiology. E-mail:liiffyuu@163.com

(責任編輯：郭柏壽Responsible editor:GUO Baishou)

Effect of Altitude Chronic Hypoxia on HIF-2α, EPO and in Yak and Migrated Cattle on Qinghai-Tibetan Plateau

LIU Fengyun, LI Yuxian, HU Lin, LIU Shiming, QI Shenggui,YANG Lei, TANG Yongping and WU Tianyi

(National Key Laboratory of High Altitude Medicine, Qinghai High Altitude Medical Research Institute, Xining810012, China)

AbstractIn order to investigate the difference adaptive features of red blood cell's parameter and its correlation with serum HIF-2α and EPO between yak and migrated cattle on Qinghai-Tibetan plateau, the serum samples of yak were collected under 3 500 m and up 3 500 m respectively in Qinghai, meanwhile the serum samples of migrated cattle on plateau (2 500 m) and lowland cattle (1 300 m) were also collected. The levels of hematocrit (HCT), mean corpuscular volume (MCV), mean red blood cell hemoglobin content (MCH) etc. in serum were measured by using fully automatic hematology analyzer, and the levels of hypoxia inducible factor-2a ( HIF-2α) and erythropoietin (EPO) in serum were measured by using enzyme linked immunosorbent assay. We analyzed the differences of the above and its correlation with HIF-2α and EPO. We used one way analysis of variance (ANOVA) and independent-samples t-test. The results showed that the levels of RBC, HB, and HCT in >3 500 m group of yak increased significantly compared with other groups which live in <3 500 m. As compared to migrated cattle and lowland cattle, the serum level of RBC was decreased whereas the level of MCH, HIF-2α and EPO of yak were increased significantly, respectively. The levels of RBC, HB, HCT, and MCH were significantly correlated to levels of HIF-2α, and a high correlation between HIF-2α and EPO in yak. The levels of RDW-SD was only correlated to the serum EPO activities in migrated cattle, whereas it was showed there were correlations between MCH and HIF-2α and between HIF-2α and EPO in lowland cattle. These results indicated that hypoxic caused by altitude take a key role in the changes of RBC, HB, HCT and RDW-CV levels in mountainous yaks. Compared with the migrated cattle and lowland cattle, lower levels of RBC, MCH and RDW-CV, and higher levels of HIF - 2a and EPO were the characteristics of the yak to adapt to hypoxic environment of high altitude. The levels of RBC, HB, HCT, MCV, MCH and RDW-SD in serum of yak had more sensitive to the changes of HIF-2α. The results suggest that yaks are genetically and successfully adapted to high altitude.

Key wordsChronic hypoxia; Yak; Migrated cattle; Blood cells; HIF-2a; EPO

收稿日期：2015-07-23修回日期：2015-11-27

基金項目：科技部973前期資助項目(2012CB722506)；科技部973資助項目(2012CB518202)。

通信作者：吳天一，男，研究員，工程院院士，研究方向為低氧生理與高原病。E-mail:wutianyiqh@hotmail.com

中圖分類號Q494

文獻標志碼A

文章編號1004-1389(2016)04-0490-06

Corresponding authorWU Tianyi, male, professor, Chinese academy of engineering. Research area:hypoxic physiology and mountain sickness. E-mail:wutianyiqh@hotmail.com

網絡出版日期：2016-04-02

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160402.1111.004.html

第一作者：劉鳳云，女，研究員，研究方向為低氧生理。E-mail:liiffyuu@163.com