基于iTRAQ標記結合IPA生物分析平臺篩選異常黏液質型陽痿病證大鼠血清蛋白質組學研究*

馬文靜毛吾蘭?買買提依明張盼盼斯依提?阿木提劉鳳霞薛志琴蔣 萍阿萊?巴合提汗阿地力江?伊明**

1. 新疆醫科大學中心實驗室（烏魯木齊 830011）; 2. 新疆醫科大學基礎醫學院生物學教研室; 3. 新疆醫科大學基礎醫學院人體解剖教研室; 4. 新疆醫科大學基礎醫學院生理學教研室

·論 著·

基于iTRAQ標記結合IPA生物分析平臺篩選異常黏液質型陽痿病證大鼠血清蛋白質組學研究*

馬文靜1毛吾蘭?買買提依明2張盼盼3斯依提?阿木提3劉鳳霞3薛志琴3蔣 萍4阿萊?巴合提汗3阿地力江?伊明3**

1. 新疆醫科大學中心實驗室（烏魯木齊 830011）; 2. 新疆醫科大學基礎醫學院生物學教研室; 3. 新疆醫科大學基礎醫學院人體解剖教研室; 4. 新疆醫科大學基礎醫學院生理學教研室

目的 應用 iTRAQ 標記技術結合IPA生物分析平臺，篩選異常黏液質型陽痿病證特異性差異表達蛋白候選標志物，并探討其分子機制。方法 建立異常黏液質證候模型，并篩選陽痿病證模型后，分為正常組（N）、證候組（B1）和病證組（A1）共3組（n=10），分離血清， 進行iTRAQ標記結合LC-MS-MS蛋白質組學分析，應用IPA在線生物平臺對異常黏液質型陽痿病證組大鼠血清差異表達蛋白進行蛋白質調控網絡分析、生物功能分析、典型通路分析和生物標志物篩查分析。結果 通過蛋白質組學技術獲得61種異常黏液質型陽痿病證血清差異蛋白，IPA 分析結果為，候選差異表達蛋白質中6種與血管內皮功能相關；3 種與平滑肌活動相關；10種與炎癥相關。參與的主要生物學過程為損傷反應、炎癥反應和防御反應等，涉及的主要通路為LXR/RXR通路和FXR/RXR通路等，并獲得與勃起功能障礙疾病相關的標志物4個，分別是C反應蛋白、血管緊張素原、T-激肽原1以及β-2-糖蛋白1。結論 炎癥和血管內皮功能改變可能在該病證發生發展中發揮著關鍵性作用， 上述4種蛋白可能可以作為異常黏液質型陽痿病證大鼠與勃起功能障礙疾病相關的血清候選差異蛋白。

異常黏液質; 陽萎; IPA 生物信息學分析; 血清生物標志物

陰莖勃起作為一種正常的生理反應，是在內外信息刺激下，由多種生物活性因子綜合調節的神經-血管性生物活動。勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED），指男子陰莖不能勃起或不能維持足夠勃起而完成滿意性生活的病癥，并可伴發早泄，在傳統醫學中又稱陽痿， ED發生的具體機制可因內分泌、神經、血管、營養和環境等各種內外因素，或（和）全身性疾病與局部陰莖疾病影響陰莖勃起相關環節而發生。

維吾爾醫學（維醫）是祖國傳統醫學中一顆靚麗瑰寶，在長年的維醫臨床實踐中，對生殖疾病表現出極大的優勢，并以臨床療效著稱。本研究以陽痿維醫臨床4種證型中發病率最高的異常黏液質型陽痿為切入點，再依據維醫理論，“病因”造模理念指導下，建立異常黏液質型陽痿病證動物模型基礎上，應用蛋白質組學中的iTRAQ 標記技術，對該病證模型大鼠血清特異性差異表達蛋白標志物進行了鑒定與篩選，并結合IPA（Ingenuity PathwayAnalysis）生物分析平臺分析了該病證發生和發病機理，尋找疾病候選蛋白，開展蛋白質調控網絡分析、生物功能分析、典型通路分析和生物標志物篩查分析。為建立該病證特異性血清蛋白標志物體系，開展陰莖勃起功能相關的蛋白及信號轉導調控網絡研究奠定了基礎，具體報道如下。

材料與方法

一、實驗動物

隨機選取具有正常性功能的雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠70只（由交配實驗和陰莖勃起實驗證實），體質量（195±16）g；雌性大鼠20只，由新疆醫科大學實驗動物中心提供。

二、實驗試劑與材料

濕寒性飼料（新疆醫科大學實驗動物中心制備）；阿撲嗎啡（Apomorphine，APO，美國Sigma公司）；黃體酮（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：I20804）；雌二醇（寧波市三生藥業有限公司，批號:B130613）；戊巴比妥鈉；尿素購自于GibcoBRL公司；乙二胺四乙酸（EDTA）、PMSF、過硫酸胺和考馬斯亮藍染料 G250均為Amesco公司產品；二硫素糖醇（DTT）和碘乙酰胺（IAM）購自于Promega 公司；丙烯酰胺、SDS、N，N，N’，N-四甲基乙烯二胺（TEMED）和溴酚藍購自SIGMA 公司；乙醇、乙酸和甲酸購自北京化工廠；乙腈和甲醇購自 Fisher Scientifc公司；iTRAQ?Reagent-8Plex Multiplex Kit購自于 Biosystem公司；strata-X C18 除鹽柱和SCX 強陽離子交換柱購自于phenomenex公司。

三、實驗儀器及分析軟件

BIC-400 型人工氣候箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；BS-1105型電子天平（北京賽多科斯天平有限公司）；DHG-9245A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；島津常規液相；戴安納升液相；Q-Exactive 質譜儀（Thermo fisher）；UMAX Powerlook 2100XL-USB 掃描儀；IKA 振蕩器；Tanon 電泳槽；DYY-7C 型電泳儀（北京六一儀器廠）；恒溫加熱塊（鼎國昌盛生物技術有限公司）；離心機（eppendorf centrifuge 5417R型）； LX-100 手掌式離心機（其林貝爾儀器）；電熱恒溫水浴鍋(長安科學儀器) ；數據采集軟件：Thermofisher Proteome Discoverer 1.3 ；Mascot 軟件版本：2.3.0； IPA 在線生物信息軟件平臺（Ingenuity Systems公司）。

四、實驗方法

（一）實驗動物分組

將田口法正交應用于五階恒流快速充電方法中,進行電池充放電實驗,測量充電時間和充電容量的百分比將其作為模糊控制器的輸入量,從而提高充電效率。

取70只雄性SD大鼠，適應性飼養 1 周，自由飲水、進食，12/12 h 晝夜交替飼養，飼養環境溫度（20±2）℃、濕度40%~60%，并對大鼠生物學表征進行動態觀察和記錄，一周后行交配實驗和APO實驗證實具有正常的性功能后，從中隨機挑選出10只為正常對照組（N），余60只為造模組，并開始造模。

（二）異常黏液質證與陽痿病證大鼠模型的建立

以“濕寒性環境+濕寒性飼料”符合干預方法建立異常黏液質證候模型，并從中篩選ED模型后分組為病證組（A1）和病證藥物干預組（A3），未成ED者分為證候組（B1）和證候藥物干預組（B3），并設立正常對照組，經維藥伊木薩克片口服干預2周后取材（其中證候藥物干預組和病證藥物干預組用于其他實驗） ，具體方法見文獻[1,2]。

（三）取材

實驗終結時，用1%戊巴比妥鈉腹腔注射（50mg/ kg）麻醉，快速從腹主動脈取血，置于4℃環境30min后，在4℃離心機離心（1000~1400×g）15min獲取血清，分裝后凍存于-80℃冰箱備用。

（四）低豐度蛋白樣品的制備和血清蛋白質組學分析

各組大鼠分別取10份血清樣本，進行等體積混樣制備N組、B1組和A1組大鼠血清樣品，每組體積為1000μL，利用低豐度蛋白富集試劑盒（多肽配體親和層析柱）特異性吸附并制備血清低豐度蛋白組，測定總蛋白含量。每組樣品取 50μg 蛋白體積，并用胰蛋白酶酶解得到相應各組肽段，按照說明書操作及標記消化后的各組肽段，對照組和造模組樣品分別加入iTRAQ 113、114和115試劑進行標記。標記結束后，用HPLC強陽離子交換柱進行分離分級，收集穿流以及洗脫部分合并，之后予C18 反相色譜除鹽，除鹽后的肽段經Q-Exactive 質譜儀進行質譜分析。Q-Exactive 質譜儀檢測肽段信號，參數為離子模式為陽離子模式，毛細管溫度為320℃，檢測方式為正離子。質譜掃描完畢，將質譜圖輸入到 PD（Proteome discoverer 1.3，thermo）軟件，PD 提取后的譜圖用mascot 進行搜索，PD 軟件根據 mascot 搜索結果和第一步篩選后的譜圖進行定量分析，最終得到經鑒定的蛋白數量及種類。

（五）差異蛋白的IPA 生物信息學分析

在 iTRAQ標記技術結合LC-MS-MS基礎上，結合維醫理論篩選出異常黏液質型陽痿病證組大鼠模型血清差異候選蛋白，通過IPA 在線生物信息學分析平臺對獲得的差異候選蛋白進行調控網絡分析（Networks analysis）、生物功能分析（Biofuction analysis）、 典型通路分析（Canonical pathways）和IPA生物標志物篩查分析（IPA-biomarker~Filter），并進一步探討其可能的作用網絡與候選生物標志物。

結 果

一、iTRAQ技術鑒定血清蛋白結果

經iTRAQ標記技術結合LC-MS-MS，結合維醫理論，篩選出異常黏液質型陽痿病證差異候選血清蛋白為血管緊張素原、T-激肽原1、T-激肽原2、心房利鈉肽受體2、β-2-糖蛋白1、黏著斑蛋白、銅轉運ATP酶1、血小板-白細胞C激酶底物、 突觸小泡磷酸酶-2、α-1-酸性糖蛋白、α-1-抗蛋白酶、絲氨酸蛋白酶抑制劑A3N、α-1-3抑制劑、C反應蛋白、肌紅蛋白-1、蛋白質UNC-13同源D等61種蛋白，其中上調表達蛋白40種，下調表達蛋白21種。

二、IPA生物信息學分析結果

（一）差異蛋白調控網絡分析

結果顯示，該病證大鼠模型血清中的差異蛋白集中參與的相互作用功能子網絡主要集中在（1）細胞裝配和形成、組織發育、細胞與細胞的信號傳導和相互作用；（2）心血管系統發育和功能、器官形態、細胞間信號和互動；（3） 細胞死亡和生存、DNA復制和重組與修復、細胞形態；（4）癌癥、血液疾病、免疫疾病等4個功能模塊，見表1。

（二）生物功能分析

1. 蛋白質功能注釋：結果顯示，差異表達蛋白質中與血管內皮相關蛋白質為血管緊張素原、T-激肽原1、T - 激肽原2、心房利鈉肽受體2、β-2-糖蛋白1和黏著斑蛋白等6 種；與平滑肌活動相關蛋白質為銅轉運ATP酶1、β-2-糖蛋白1和心房利鈉肽受體2等 3 種；與脂質代謝相關蛋白質為血管緊張素原、 β-2-糖蛋白1、 血小板-白細胞C激酶底物和突觸小泡磷酸酶-2 等4種，與炎癥相關蛋白質有T-激肽原1、 α-1-酸性糖蛋白、α-1-抗蛋白酶、T - 激肽原2、絲氨酸蛋白酶抑制劑A3N、血清鐵傳遞蛋白、α-1-3抑制劑、C反應蛋白、肌紅蛋白-1和蛋白質UNC-13同源D等 10種。

2. 生物學過程分布：結果顯示，該病證大鼠模型血清中的差異蛋白主要參與了損傷反應、急性期和炎癥反應、防御反應、蛋白質復合物合成以及血液循環等過程。圖1只列出前l0位主要涉及的生物學過程。

3. 分子功能分析：結果顯示，上述候選蛋白質主要發揮肽酶抑制劑活化、氧氣結合、運輸、肌動蛋白質結合以及有機酸結合等功能。圖2只列出前l0位主要涉及的分子功能。

（三）典型通路分析

結果顯示，上述差異表達的蛋白主要涉及的信號通路為急性炎癥反應通路、LXR/RXR通路、FXR/ RXR通路、上皮黏著連接通路、生殖細胞-睪丸支持細胞連接信號通路、肝纖維化/肝星狀細胞活化通路、14-3-3 介導的信號傳導、凝血系統通路及吞噬體成熟通路。圖3只列出主要涉及的前l0位通路。

表1 異常黏型陽痿病證大鼠模型血清中差異蛋白涉及的4個功能模塊

圖1 血清差異表達蛋白質生物學過程分布

圖2 血清差異表達蛋白質分子功能分布

圖3 血清差異表達蛋白質信號通路分布

（四）生物標志物的篩選分析

1. 蛋白標志物篩選：結果顯示，上述差異表達的候選血清蛋白標志物，經IPA疾病標志物分析模塊分析，其中C反應蛋白（CRP）、血管緊張素原（AGT）、T-激肽原1（MAP1）和 β-2-糖蛋白1（β2GP1）屬于ED血清蛋白標志物 （表2）。

2. 生物標志物的相互作用網絡：對通過IPA疾病庫獲得的與ED相關4種蛋白構建了相互作用網絡圖（圖4），結果顯示，上述4種蛋白質存在直接或間接的相互作用關系，其中IL-6間接的影響了這4個蛋白表達， 4個差異蛋白均呈現上調表達趨勢。網絡中的紅色點為實驗數據中的上調差異表達蛋白，實線表示直接信號通路，虛線表示間接信號通路。

表2 異常黏液質型陽痿病證大鼠血清中ED生物標志物的IPA篩選分析

圖4 勃起功能障礙候選蛋白質標志物相互作用網絡

討 論

維吾爾醫學（維醫）作為祖國傳統醫學寶庫中的重要成員，經歷史積淀，形成了其獨特的診療體系，對陽痿、早泄和少弱精子癥等生殖類疾病表現出極大的療效優勢。前期工作中，本研究團隊在成功建立異常黏液質型陽痿病證大鼠模型的基礎上，結合對應藥物干預開展了其生殖生物學基礎研究，從神經內分泌免疫網絡（NEI）與陰莖勃起相關傳導通路方面初步揭示了該病證的科學內涵與對應藥物的作用機制。但異常黏液質型陽痿作為全身性疾病，遠未能揭開其發生發展規律，闡明其核心機制，需進一步深入研究。蛋白質組學的出現與發展為該領域的研究提供了新的途徑，使疾病的研究思路和方法從個別或單一基因表達調控差異研究層次發生了跳躍，轉入更高層次，使我們從整體水平層次上對機體與環境之間的相互影響開展研究，并做出全面而系統評價成為可能。維醫辨證分型的起點和核心是維醫“體液論”，其出發點是人體內在體液動態變化的外在表現，而維醫藥學所推崇的辨證施治也是依據個體的整體水平上發生的體液表型差異，這與系統生物學整體研究思路也不謀而合。

本研究中，本團隊通過同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）技術結合LC-MS-MS研究了異常黏液質型陽痿病證，并獲得大鼠血清候選差異蛋白61種，其中上調表達蛋白40種，下調表達蛋白21種。通過IPA的蛋白質功能注釋，發現其中有6種蛋白質與血管內皮功能相關，3種蛋白質與平滑肌功能相關，提示，該病證發生發展過程當中血管內皮功能和平滑肌功能改變發揮著關鍵性作用，更可能是其核心病理機制，這一點與以往的研究報道[3-5]相吻合。同時有10種蛋白質與炎癥相關，其中T-激肽原1，α-1-酸性糖蛋白和C反應蛋白均屬于急性時相期蛋白；生物功能分析結果表明，該病證差異蛋白的生物功能主要集中在損傷反應、炎癥反應、防御反應等，提示，該病證的發生發展中炎癥可能發揮著重要作用。典型通路分析結果表明，差異蛋白主要涉及LXR/RXR通路和FXR/ RXR通路，結合文獻[6,7]研究發現，上述通路與炎癥和脂質代謝、糖代謝密切相關。結合我們以往的研究結果[8-10]，我們認為該病證發生發展可能與慢性炎癥引發的NEI紊亂和代謝功能改變有關，并可進一步影響血管內皮功能，但尚需進一步驗證，尤其是需要結合本研究差異蛋白調控網絡分析的結果，就其具體機制進行進一步探索。

本研究中，在篩查出的差異蛋白質中，經IPA進一步篩查，得出CRP、AGT、MAP1和β2GP1 4種蛋白是ED血清標志物，其中CRP是體內重要的促炎癥細胞因子，能使內皮細胞及血管平滑肌細胞等一氧化氮（NO）表達及分泌降低，內皮素-1（ET-1）表達和分泌增加。另有學者報道[11,12]，ED患者較高的CRP水平可通過下調 eNOS的表達，促使內皮細胞凋亡，減弱血管內皮損傷后的內皮細胞再生，影響血管內皮功能。AGT在腎素的作用下可以產生血管緊張素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，其中血管緊張素Ⅱ具有強烈的縮血管的作用，調節陰莖勃起功能[13]。有研究報道[14]，血管緊張素Ⅱ主要分布在陰莖海綿體血管內皮細胞的內層及平滑肌束中，器質性 ED患者的海綿體局部和外周血液中Ang-Ⅱ濃度均顯著增高。激肽原屬于激肽釋放酶-激肽系統（KKS），是生物體內重要的炎性調節系統，參與心血管、腎和中樞神經系統等各組織器官的炎癥過程，分為高分子量（HMW）、低分子量（LMW）、T-激肽原1（MAP1）和T-激肽原2（MAP2）[15]。 激肽原作為作為活性肽和緩激肽的前體，可影響平滑肌收縮，誘導低血壓和血管通透性增加。體外實驗證實[16]，KKS系統的活性成分可以舒張人陰莖海綿體，但其是否存在于生理狀態下的陰莖海綿體組織中尚未見報道。β2GP1 作為一種生理性蛋白在糖尿病、動脈粥樣硬化及血管新生過程中發揮著重要作用，其中β2GP1與血小板之間的關系研究較多，有報道[17]稱，內皮細胞的損傷使血小板活化后，釋放的炎癥遞質及細胞因子可誘導并促進動脈粥樣硬化的發生、發展，進而促使ED發生，并認為血小板及其相關功能指標也作為 ED診療中的一類重要指標。本研究結果顯示，CRP、AGT、MAP1和β2GP1 4種蛋白作為異常黏液質型陽痿病證大鼠血清候選標志物，均顯著上調，且在IPA分析中顯示它們是ED血清標志物，結合以往的研究，我們認為，其可能直接或間接參與了該病證的發生發展過程，并可作為異常黏液質型陽痿病證重要的血清標志物之一。

綜上所述，本研究基于生物信息學IPA平臺對iTRAQ技術結合LC-MS-MS獲得的蛋白質組學數據進行進一步挖掘與分析，我們認為異常黏液質型陽痿病證屬于全身性疾病，炎癥-NEI紊亂和代謝功能改變在其發生發展中可能發揮著關鍵性的作用，在候選指標中，可在將CRP、AGT、MAP1和Β2GP1作為異常黏液質型陽痿病證血清標志物基礎上，進一步對其它候選蛋白標志物進行驗證后，確定其他蛋白標志物，并建立相應體系，為進一步開展功能網絡調控研究，以揭示該病證的發生發展規律，并為基于標志物基礎上的臨床基礎研究和藥物篩選奠定基礎。

1 阿地力江?伊明, 潘建春, 哈木拉提?吾甫爾, 等. 幾種不同方法建立維醫異常黏液質陽痿病證模型的研究. 新疆醫科大學學報 2010; 33(11): 1275-1280

2 阿地力江?伊明, 范強, 潘建春, 等. 維醫異常黏液質陽痿病證動物模型的建立. 中國男科學雜志 2011; 25(9): 3-9

3 任黎剛, 李錚. 保護陰莖血管內皮功能:勃起功能障礙治療新途徑. 中華男科學雜志 2011; 17(2): 160-164

4 Blick C, Ritchie RW, Sullivan ME. Is erectile dysfunction an example of abnormal endothelial function?. Curr Vasc Pharmacol 2016; 14(2): 163-167

5 劉本春, 林桂亭, 辛鐘成. 陰莖海綿體平滑肌收縮的分子機理研究進展. 中國男科學雜志 2006; 20(9): 52-55, 58

6 Tang H, Mirshahidi S, Senthil M, et al. Down-regulation of LXR/RXR activation and negative acute phase response pathways in colon adenocarcinoma revealed by proteomics and bioinformatics analysis. Cancer Biomark 2014; 14(5): 313-324

7 Vavassori P, Mencarelli A, Renga B, et al. The bile acid receptor FXR is a modulator of intestinal innate immunity. J Immunol 2009; 183(10): 6251-6261

8 阿地力江?伊明, 張盼盼, 阿麗艷?阿合麥提, 等. 糖尿病對大鼠陰莖組織中eNOS和nNOS的影響及胰島素的治療作用. 新疆醫科大學學報 2008; 31(8): 923-927

9 阿地力江?伊明, 潘建春, 哈木拉提?吾甫爾, 等. 維醫異常黏液質證侯與陽痿病證大鼠模型生殖激素的改變及其生物學意義. 新疆醫科大學學報 2012; 35(11): 20-23

10 顧亞楠, 沙地克?沙吾提, 阿地力江?伊明. 半去勢雄性大鼠外周血中睪酮代償性變化的研究. 新疆醫科大學學報 2010; 33(11): 1280-1282

11 Shwartz R, Osborne-Lawrence S, Hahner L, et al. C-reactive protein downregulates endothelial NO synthase and attenuates reendothelialization in vivo in Mice. Circ Res 2007; 100(10): 1452-1459

12 Arrabal-Polo Má, Arias-Santiago S, López-Carmona Pintado F, et al. Metabolic syndrome, hormone levels, and inflammation in patients with erectile dysfunction. Sci World J 2012; 2012: 272769

13 Maas R, Schwedhelm E, Albsmeier J, et al. The pathophysiology of erectile dysfunction related to endothelial dysfunction and mediators of vascular function. Vasc Med 2002; 7(3): 213-225

14 Becker AJ, Uckert S,Stief CG, et al. Possible role of bradykinin and angiotensin II in the regulation of penile erection and detumescence. Urology 2001; 57(1): 193-198

15 Joe B, Nagaraju A, Gowda LR, et al. Mass-spectrometric identification of T-Kininogen I/Thiostatin as an acutephase infammatory protein suppressed by curcumin and capsaicin. PLoS One 2014; 9(10): e107565

16 Teixeira CE, Moreno RA, Ferreira U, et al. Pharmacological characterization of kinin-induced relaxation of human corpus cavernosum. Br J Urol 1998;81(3):432-436.

17 姜睿, 龍皓. 血小板與陰莖勃起功能障礙. 中華男科學雜志 2015; 21(9): 771-774

（2016-10-08收稿）

Serum proteomics analysis of abnormal phlegmatic rats model with impotence disease using iTRAQ and IPA bioanalysis platform*

Ma Wenjing1, Maowulan Maimaiti2, Zhang Panpan3, Siyiti Amuti3, Liu Fengxia3, Xue Zhiqin3, Jiang Ping4, Alai Bahetihan3, Adilijiang Yiming3**
1. Central Laboratory, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China; 2. Department of Biology, College of Basic Medicine, Xinjiang Medical University; 3. Department of HumanAnatomy, College of Basic Medicine, Xinjiang Medical University; 4. Department of PhysiologyCollege of Basic Medicine, Xinjiang Medical University Corresponding author: Adilijiang Yiming, E-mail: adljym@163.com

Objective To screen the candidate serum biomarkers for abnormal phlegmatic syndrome with impotence disease using iTRAQ and IPA bioanalysis platform, and explore its molecular mechanism. Methods Rats with abnormal phlegmatic syndrome model were established, and abnormal phlegmatic syndrome rats model with impotence were selected and divided into three groups: the control group(N), phlegmatic syndrome model group(B1) and phlegmatic syndrome model group with impotence (A1) (n=10). Serum proteomics of these rats among three groups were comparatively analyzed by iTRAQ labeling combined with LC-MS-MS. Differentially expressed serum proteins were further analyzed by IPA online bioinformatics software,including networks analysis, biofunction Analysis, canonical Pathways and IPA Biomarker~Filter analysis. Results Total of 61 differentially expressed serum proteins were identifed by iTRAQ. IPA bioanalysis showedthat 6 different proteins were associated with vascular endothelial function, 3 proteins of smooth muscle activity,10 proteins associated with infammation. The main biological processes of differential proteins were injury, infammation reaction and defense response. The pathways involved in LXR/RXR activation and FXR/RXR activation. Four candidate biomarkers associated with Erectile Dysfunction disease were found, including C-reactive protein, Angiotensinogen, T-kininogen-1 and β-2-glycoprotein 1. Conclusion Infammation and vascular endothelial function may play a key role in the development of this disease, four proteins can be used as candidate proteins related to abnormal phlegmatic with impotence disease.

Abnormal phlegmatic syndrome; Impotence; IPA@bioinformatics analysis; biological markers

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.12.001

R 698.1

資助：國家自然科學基金項目（81260581）**

，E-mail: adljym@163.com