緩釋硫化氫供體對小鼠腦缺血急性期保護作用實驗研究*

蘇州大學神經科學研究所(蘇州215123)

徐英秀　肖蘊祺　賈　佳▲

?

緩釋硫化氫供體對小鼠腦缺血急性期保護作用實驗研究*

蘇州大學神經科學研究所(蘇州215123)

徐英秀肖蘊祺賈佳▲

摘要目的：探討緩釋硫化氫緩釋供體對小鼠腦缺血再灌注損傷的影響。方法：采用線栓法建立小鼠局灶性腦缺血模型，將雄性 ICR 小鼠隨機分為假手術組(Sham)、溶劑對照組(Veh)和緩釋硫化氫緩釋供體ADT-OH 組。缺血再灌24h取腦組織，利用TTC染色法檢測小鼠腦梗死體積；通過實時定量 PCR (qPCR)檢測組織中炎癥因子。結果：TTC染色結果顯示，與Veh相比，ADT-OH能夠顯著降低腦缺血再灌注后大腦皮層、內囊以及大腦半球的梗死體積；qPCR 結果顯示，與 Sham 組相比，Veh 組小鼠的缺血皮層組織中促炎因子iNOS、 IL-1β、TNF-α和IL-6 的表達水平明顯升高；與 Veh 相比，ADT-OH顯著降低促炎因子表達。結論：硫化氫緩釋供體對急性期腦缺血損傷具有一定的保護作用，機制可能與抑制腦缺血損傷誘導的炎癥反應相關。

主題詞硫化氫@供體腦缺血/病理生理學再灌注損傷炎癥介導素類小鼠

腦卒中可分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩種類型，其中約 80%以上是缺血性腦卒中。缺血性腦卒中是因為腦部動脈供血區的血流栓塞或出血而暫時或永久地減少導致的腦組織缺血。對于腦缺血的治療，目前唯一有效手段是在病發3h內給予組織纖溶酶原激活物(Recombinant tissue plasminogen activator, rtPA)，降低神經功能損傷。然而，這種治療手段存在很大的風險，首先，rtPA有可能會造成患者腦出血。其次，大部分病人并不能在病發3h內接受rtPA的治療。因此，對于此病的治療和預防各國都在積極研究尋找有效的藥物。

硫化氫(H2S)是一種具有臭雞蛋氣味的氣體，一直被認為是一種有害氣體，由血中進入機體細胞后,硫化氫和細胞呼吸酶結合,并因此阻斷細胞內呼吸，使中樞神經細胞以及敏感的呼吸中樞細胞受損，同時硫化氫在短時間內的濃度猛增會有致死作用。然而，上世紀80年代末人們檢測到在生理狀態下腦組織中存在一定量的H2S，并且對機體發揮重要作用。 H2S與多種神經系統疾病都有著密切的關系，在肝臟等多種器官的缺血-再灌注損傷中具有保護作用[1-3]。但目前關于硫化氫供體在腦缺血模型中的研究較少。

最近，有研究表明H2S可以抑制LPS誘導的中樞神經炎癥[4]。然而在小鼠急性期腦缺血再灌注損傷時H2S如何發揮作用及其是否對炎性細胞因子的調節作用尚不清楚。因此，本研究應用小鼠腦缺血模型，分別觀察腦缺血損傷后給予H2S緩釋供體ADT-OH對腦組織中炎癥因子iNOS、IL-1β、TNF-α、IL-6表達的影響，從炎癥反應角度探討H2S在小鼠急性期腦缺血中的作用。

資料與方法

1材料清潔級ICR小鼠(上海斯萊克公司)；5-對羥基苯基-1, 2-二硫雜環戊烯-3-硫酮(ADT-OH)(蘇州大學藥化實驗室)；TTC(美國 Sigma 公司)；RNAiso Plus(寶生物工程有限公司)；cDNA逆轉錄試劑盒及SYBR Green I購自美國Invitrogen公司。

2方法

2.1小鼠局暫性大腦中動脈栓塞(tMCAO)模型建立：將小鼠腹腔注射水合氯醛(10g/ml)，使其完全麻醉；將小鼠固定在手術臺上腹部向上，在顯微鏡下，打開頸部，鈍性分離頜下腺，從小鼠右邊氣管處分離出頸總動脈，用縫合線輕微扎住。然后，繼續向頭部分離，分離到頸總動脈分叉處，將頸外動脈分離，用縫合線扎緊，電凝燒斷頸外動脈分支。同時扎緊頸總動脈。隨后，將頸外動脈用縫合線拉緊，在靠近結扎處，剪一小口，插入線拴，緩緩前進至頸內動脈并沿入顱骨方向推進，同時觀察血流儀數值，當數值突降約至基值30%，停止插栓，用縫合線將線拴系緊，然后將小鼠縫合。手術過程中，加熱燈保持溫度(37℃±0.5℃)。小鼠缺血1h后，拔出線栓，回復血流，實現再灌注。假手術組不插入線栓，其余操作與手術組相同。

2.2實驗分組：小鼠缺血再灌注3h后隨機分組，經腹腔注射給予ADT-OH(50 mg/kg)或溶劑對照組(Veh )。再灌注24h取組織進行TTC染色或檢測炎癥因子的表達。

2.3TTC染色：將小鼠脫臼處死，小心取出完整的腦，并將腦切成 2 mm厚的切片，置于 1%的 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)中，37℃恒溫水浴，5 min后，去除 TTC 染色劑，并用干凈的吸水紙吸取腦切片表面的水分。將染好腦片倒入10%的多聚甲醛溶液，淹沒切片為宜，固定 24 h后，拍取照片，用圖像分析軟件統計分析梗死體積(正常腦組織染為紅色，梗死腦組織染為白色)。

2.4實時熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR, qPCR)：于-80℃取出腦組織樣本，立即加入適量RNAiso Plus(根據組織大小估量)，用研磨棒快速反復研磨勻漿，室溫靜置 5min，移至高速冷凍離心機，配平，4℃ 12000rPm 離心 5min，謹慎吸取上清液，移入新 1.5ml EP 管中(切勿吸取沉淀)，按照RNA抽提試劑盒的操作提取總RNA，采用NanoDrop檢測RNA含量，按照逆轉錄試劑盒操作說明于 PCR儀上反轉錄合成 cDNA(25℃ 10min，37℃ 120min，85℃ 5s，4℃ ∞)。在ABI 7500 PCR 儀上進行PCR擴增。PCR 擴增后進行溶解曲線觀察分析非特異性擴增和引物二聚體是否存在，Ct 值用 2∧-△△Ct法計算基因表達量差異，以 18S 為參照基因。引物序列見表1。

2.5統計學方法：采用SPSS 13．0統計學軟件定量實驗數據采用均數±標準差表示，兩獨立組間比較采用t檢驗，多組間用one-way Anova檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

表1　引物序列表

結果

1ADT-OH 處理減少缺血后的腦梗死體積缺血再灌注 3 h后給予ADT-OH(50mg/kg)處理，再灌注 24 h后收取腦組織，進行 TTC 染色(圖1)，結果與溶劑對照組(Veh)相比，ADT-OH處理組(ADT-OH)梗死體積明顯減少。溶劑對照組(Veh)皮層、內囊、半球梗死體積分別為 66.0±6.9%、64.0±25.2%、60.0±9.3%；ADT-OH組皮層、內囊、半球梗死體積分別為38.5±12.8%、35.1±5.6%、31.0±8.5%。結果顯示(圖2)：ADT-OH 可明顯降低皮層、內囊和半球的梗死體積(*P<0.05);與溶劑對照組(Veh)相比，ADT-OH處理組(ADT-OH)的皮層、內囊和半球的梗死體積百分率明顯降低(*P<0.05)。

2ADT-OH 明顯降低腦缺血后皮層組織中促炎因子的表達已有文獻表明急性期腦缺血再灌注損傷會誘導大量促炎癥因子釋放，進一步加劇腦組織損傷，而促炎因子iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6都被證明與腦缺血中腦組織損傷相關。因此，本實驗通過Real-time PCR檢測iNOS、IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA水平，驗證是否ADT-OH對腦缺血損傷的保護作用是通過抑制上述促炎因子表達而實現的。本實驗中我們造小鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)，小鼠缺血再灌注3h通過腹腔注射ADT-OH和Veh(對照)，再灌注24h提取RNA。結果顯示(圖3)：與假手術(sham)組相比，Veh 組小鼠的缺血皮層組腦組織中促炎因子(iNOS、IL-1β、TNF-α、IL-6)的表達顯著升高(*P< 0.05，**P<0.01)，與注射veh的缺血側相比， ADT-OH組缺血側促炎因子表達明顯降低(*P< 0.05，**P<0.01)。提示在小鼠腦缺血模型中ADT-OH能夠抑制腦缺血再灌注引起的中樞神經炎癥 。

討論

硫化氫和NO、CO同屬于“氣體遞質”家族，它在不同組織和器官中都具有重要的生理作用，H2S能影響神經突觸傳遞，增強海馬長時程記憶，并影響膠質細胞和周圍細胞的信號傳遞，氧化應激而產生的內源性H2S還具有重要的抗氧化功能。H2S對于調節神經功能活性，抵制大腦缺血性損傷都有一定作用。然而，硫化氫在腦卒中方面的研究卻一直存在爭議，有文獻報道在全腦大鼠腦缺血再灌注模型中發現，在腦缺血再灌注12h大鼠前腦皮質組織中H2S含量顯著升高，而再灌注24h檢測H2S含量明顯下降[5]，腦缺血早期(12h)產生較高水平的H2S，其原因可能是機體對神經元興奮性作出的一種反應。再灌注24h大鼠腦組織H2S水平出現下降可能與H2S發揮清除自由基抗氧化等消耗有關。Ren[6]等在腦缺血再灌注模型中發現當給予25μmol/kg NaHS可抑制腦缺血引起的神經元損傷，而當給予180μmol/kg NaHS則加劇神經元損傷。究其原因，可能主要是在此研究中采用的是無機硫化氫供體NaHS，低濃度的無機供體是有神經保護作用的，但如果無機供體迅速釋放大量的硫化氫則會產生神經毒性[7]。有機的硫化氫供體，可以緩慢且持久的釋放硫化氫，其效果更優于普通的無機硫化氫供體。因此，在本研究中我們利用緩釋硫化氫供體(ADT-OH),在小鼠腦缺血再灌注3h腹腔注射ADT-OH(50mg/kg)緩慢釋放H2S，使腦內硫化氫含量維持正常的生理水平，再灌注24h收取腦組織。結果顯示，ADT-OH能夠降低腦缺血再灌注引起的皮層、內囊以及半球的梗死體積。qPCR檢測顯示，ADT-OH明顯降低缺血側促炎因子(iNOS /IL-1β、TNF-α、IL-6)的表達，進而抑制中樞神經炎癥。

本研究表明，ADT-OH能夠降低腦缺血再灌注后腦梗死體積，對腦缺血急性期損傷具有一定保護作用。ADT-OH能夠抑制腦缺血后急性期促炎因子的表達，進而抑制中樞神經炎癥，但具體機制尚不明確有待深入研究。這些結果提示硫化氫緩釋供體可能通過抑制中樞神經炎癥發揮對急性期腦缺血損傷的保護作用。

參考文獻

[1] Bos EM,Wang R， Snijder PM，etal. Cystathionine gamma-lyase protects against renal ischemia/reperfusion by modulating oxidative stress [J]. J Am Soc Nephrol, 2013, 24(5): 759-770.

[2] Elrod JW, Calvert JW,Morrison J，etal. Hydrogen sulfide attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury by preservation of mitochondrial function[J]. Proc Natl Acad Sci USA ，2007, 104(39): 15560-15565.

[3]Hunter JP，Hosgood SA，Patel M，etal. Effects of hydrogen sulphide in an experimental model of renal ischaemia-reperfusion injury [J]. Br J Surg, 2012,99(12): 1665-1671.

[4]Zhou X, Cao Y, Ao G,etal. Ca MKKβ-dependent activation of AMP-activated kinase is critical to suppressive effects of hydrogen sulfide on neuroinflammation [J]. Antioxid Redox Signal, 2014, 21(12):1741-1758.

[5]任彩麗, 李東亮, 趙紅崗,等.全腦缺血-再灌注大鼠腦組織內源性硫化氫的動態變化[J].中華腦血管病雜志，2008,5(4)：177-180.

[6]Ren C, Du A, Li D,etal. Dynamic change of hydrogen sulfide during global cerebral ischemia-reperfusion and its effect in rats[J].Brain Res,2010,1245:197-205.

[7]Li GF， Luo HK， Li LF，etal. Dual effects of hydrogen sulphide on focal cerebral ischaemic injury via modulation of oxidative stress-induced apoptosis[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2012, 39(9): 765-771.

(收稿：2015-06-02)

The Protective effects of a slow-releasing hydrogen sulfide donor to mice acute ischemia

Institute of Neuroscience, Suzhou University (Suzhou 215123)

Xu YingxiuXiao YunqiJia Jia

ABSTRACTObjective: To investigate the effects of the slow-releasing hydrogen sulfide donor ADT-OH in mice cerebral ischemic reperfusion injury. Methods: The mice focal cerebral ischemia model was found through MCAO and the male ICR mice were randomly divided into Sham, Veh, and slow-releasing hydrogen sulfide donor ADT-OH group. After 24 hours' ischemic reperfusion, the brain tissue was got out and the mice's brain infarct volumes were assessed with triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining. The expression of inflammatory factors in tissue was detected by qPCR. Results: The TTC manifested that compared to Veh, the ADT-OH could significantly reduce the cerebral infarct volume of the pallium, internal capsule and cerebral hemisphere after the ischemic reperfusion. The qPCR shown that compared to Sham, the expression level of proinflammatory factors like iNOS, IL-1β, TNF-α and IL-6 in the ischemic cortex in Veh was significantly increased; while compared to Veh, ADT-OH reduced the expression of proinflammatory factors significantly. Conclusion: ADT-OH exerted protective effects to acute cerebral ischemic reperfusion injury. The underlying mechanism may be related to the inflammatory reaction which induced by the inhibition of cerebral ischemia.

KEY WORDSHydrogen sulfide@DonorsBrain ischemia/physiopathologyReperfusion injuryInlammation mediatorsMice

通訊作者：▲蘇州大學藥學院

【中圖分類號】R363

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.03.001

·論著·基礎研究·

*國家自然科學基金資助項目(81371278)