兔Perthes病模型建立及股骨頭p53、Bcl-2表達研究*

陜西省第四人民醫院(西安710043)

張亞斌　姚永鋒　龐仲輝

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兔Perthes病模型建立及股骨頭p53、Bcl-2表達研究*

陜西省第四人民醫院(西安710043)

張亞斌姚永鋒龐仲輝

摘要目的：建立Perthes病動物模型，觀察股骨頭相關凋亡基因的變化，探討其在股骨頭壞死中的作用。方法：將32只新西蘭幼兔隨機分為實驗組和對照組，透視下經股骨頸給予實驗組(A組)右側股骨頭(實驗側)內注射醫用TH膠(含顯影劑的d-氰基丙烯酸正辛酯)0.5ml，相同方法給予對照組(B組)注射生理鹽水0.5ml，于建模后6、8、10、12 周分別取實驗組和對照組兩組右側股骨頭進行病理觀察，觀察兩組股骨頭p53 和Bcl-2凋亡基因表達變化。結果：建模后6周A組髖關節開始出現關節間隙增寬，出現點狀出血，隨著實驗期的延長變性區并逐步擴大，股骨頭骺板p53 基因表達與細胞凋亡率呈正相關性，Bcl-2 基因表達陽性率與細胞凋亡呈負相關性。B組股骨頭未見明顯異常。結論：經股骨頸注射醫用TH膠建立Perthes 病動物模型穩定，無反復，且操作簡單；證實p53和Bcl-2與Perthes 病發生相關性。

主題詞股骨頭壞死基因，p53基因,Bcl-2模型,動物細胞凋亡兔

Perthes病特指幼兒的股骨頭壞死，早期如不能得到有效治療，常并發髖關節畸形及功能障礙，且早期易引起關節炎，嚴重危及兒童的身心健康及參加社會勞動，目前病因還不明確，多數學者認為與各種原因引起的股骨頭血液供應障礙有關[1]。目前國內外學者主要針對成人股骨頭壞死的研究，且主要集中在外在病因的探尋，對于基因和分子水平研究較少。兒童的股骨頭壞死發病較少，其研究也為之更少。因此，為從基因水平了解Perthes病的病因及發病機制，為該疾病的診斷和治療提供理論依據，本實驗通過建立給予股骨頭內注射TH醫用膠建立Perthes病的動物模型，在特定時間點觀察實驗組與對照組股骨頭宏觀和微觀變化的變化，分析和研究p53和Bcl-2基因在在該疾病發病中的作用。

材料和方法

1實驗動物與分組本次實驗動物兔均來自西安交通大學醫學院動物實驗中心，32只，雌雄各半，拍片證實股骨頭骺板未閉合骨化。實驗動物隨機分為實驗組和對照組，實驗在西安交通大學第二附屬醫院骨科動物實驗室，時間為2011年12月至2012年05月，并嚴格按照《關于善待實驗動物的指導性意見》實施。

2建模將兔仰臥位固定于專用木制固定架上，給予硫噴妥鈉靜脈注射麻醉滿意后，消毒應用骨穿刺套針經股骨頸穿刺，在透視下見穿刺針到達實驗組右側股骨頭骺板遠側，向股骨頭內注入醫用TH0.5ml[2]。參照同上方法吸取0.5ml 生理鹽水注射入對照組右側股骨頭內。所有實驗動物單獨放置于專用高籠內飼養，使其處于站立位，模擬人類站立位雙側髖關節負重的生理狀態。

3實驗取材將所有實驗動物放置于相同環境下隨機分籠飼養，于建模術后第6、8、10、12周分別取實驗組和對照組動物各4只，按10 mg/kg人用氯胺酮臀大肌注射，在麻醉下給予動脈耳緣靜脈內注射氣體5ml致氣體栓塞，動物死亡后保護下解剖實驗側股骨頭，注意防止關節面損傷及人為骨折，并給予 10%甲醛溶液固定。

4實驗觀察

4.1大體變化:觀察并記錄實驗動物精神狀態、活動及體重變化,股骨頭軟骨面的顏色、形狀和硬度。

4.2組織病理學觀察：標本進行切片處理固定后，顯微鏡下將每張玻片隨機分區標記，共10個區域，并在每個區域內計數及記錄100個骨細胞及其內凋亡細胞數，每個區域內凋亡細胞總數進行合計，并對p53和Bcl-2進行指標測定。

4.3細胞凋亡檢測：凋亡細胞檢測按照TUNEL試劑盒說明書進行，可發現凋亡細胞內胞核為黃色顆粒(即陽性對照)。實驗陽性對照與陰性對照染色對比，將10個區域內凋亡細胞總數進行標記和計算占總數百分比，凋亡率=(同一類型細胞的凋亡陽性細胞計數/細胞總數)×100%。

5統計學方法采用SPSS統計學軟件，兩組樣本采用t檢驗組間比較，采用Pearson相關分析法分析股骨頭骺板細胞凋亡率與p53和Bcl-2基因表達陽性率的相關性，P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1實驗動物數量分析本次實驗動物有5只在此實驗期間曾出現腹瀉，給予口服土霉素后癥狀消失，32只動物在實驗期間全部存活進入了結果分析。

2實驗動物大體觀察實驗組動物右下肢于術后第6周出現輕微跛行，并逐漸加重至實驗結束。對照組動物右下肢正常，無異常表現。實驗觀察兩組動物體重及毛發光澤等方面無明顯異常，呈正常生長。

3股骨頭外觀變化對照組右側股骨頭外觀未見異常，與正常股骨頭基本一致。實驗組第6周時右側髖關節周圍組織開始腫脹，出現關節積液及關節間隙的增寬，隨著試驗時間延長部分股骨頭軟骨面可出現點狀充血，并逐漸擴大；到達第12周時，實驗組股骨頭雖形態正常，未見塌陷，但股骨頭軟骨面失去鮮亮色澤，可見骨質疏松明顯，骨質硬度差，易碎。

4實驗組和對照組右側股骨頭病理變化實驗組可見部分中斷，且數量減少，骨細胞內可見脂肪變性且數量減少，部分骨細胞出現凋亡現象。骺板細胞排列發生變化且厚度變薄，可見有TH膠存留于骺板小靜脈內將其栓塞(圖1)。對照組右側股骨頭內骨小梁數量，組織結構未見明顯變化，骨骺厚度及細胞形態和結構正常(圖2)。

5凋亡細胞形態根據TUNEL試劑標記可見凋亡細胞染色其胞質呈淡黃色或棕黃色，陽性信號在核內分布，周圍無炎性反應細胞，形態大小不一，核邊界清楚(圖2-c、d)。

6實驗組和對照組細胞凋亡率變化見表1。

表1　各組動物細胞凋亡率比較±s, %)

注：與對照組同期比較，*P< 0.01

7凋亡基因指標變化實驗組右側股骨頭p53和bcl-2基因的表達在第8、10、12周與對照組比較有統計學差異(P< 0.01)，見表2。

表2　兩組凋亡誘導及抑制基因率比較±s, 100%)

注：與對照組同期比較，*P< 0.01

8相關性分析結果過Pearson相關分析表明Perthes病動物模型實驗側股骨頭骺板細胞凋亡率與p53基因表達陽性率呈正相關性(P< 0.05)，與Bcl-2基因表達陽性率之間呈負相關性(P< 0.01)。

討論

當前研究已經證實Perthes病患側股骨頭的骨內壓明顯高于健側，而且患側股骨頭內一氧化氮合成酶含量也明顯高于正常側[3]，通過進一步研究發現，當發生Perthes病時，其股骨頭內的p53基因升高，而Bcl-2基因出現降低，隨著病程的發展，股骨頭關節軟骨及骺軟骨細胞也開始出現了凋亡現象[4]，Perthes病發生。研究證明，Perthes病的發生從外因上與各種原因引起的兒童股骨頭血流動力學障礙有著密不可分的關系，當某種因素造成股骨頭局部血供障礙，組織細胞出現水腫，骨內壓隨之增高，當壓力上升到足以阻擋動脈血液供入時，血液循環減少，組織進一步水腫，形成惡性循環，最終造成股骨頭骨骺毛細血管內出現淤血，局部組織缺血缺氧 、引起無氧代謝增加，組織水腫滲出增加造成骨內壓進一步升高，持續的缺血缺氧及血液回流緩慢，誘發血液的高凝狀態[5]，持續的缺氧，出現了一氧化氮含量的減少，而氧自由基增加[6]。局部微環境的變化造成了骨細胞持續缺氧，如不能及時解除，在這種病理狀態下凋亡基因p53被異常表達而凋亡抑制基因Bcl-2被抑制，表達減少，造成了局部骨細胞的壞死。在正常情況下p53能夠誘導細胞的正常凋亡，當p53基因異常表達增加而Bcl-2凋亡抑制基因減少時會引起骨細胞出現的大量的凋亡及壞死[7]。通過給股骨頭內注射醫用TH膠建立Perthes病動物模型，造成局部靜脈內栓塞，淤血，靜脈回流不暢，造成局部壓力升高，并且出現動脈血不能正常進入股骨頭內，造成局部骨細胞出現缺血缺氧，不能維持正常代謝，導致了p53凋亡基因的異常表達和Bcl-2凋亡抑制基因表達的減少，引起了骨細胞的凋亡及壞死，因此可以證實當股骨頭內血流動力學發生障礙時可以引起p53凋亡基因和Bcl-2凋亡抑制基因異常表達，該基因后期加速Perthes病的發生。實驗發現：當各種原因造成股骨頭血流動力學發生障礙時，局部的缺血缺氧狀態誘導了p53和Bcl-2凋亡相關基因的異常表達，引起骨細胞出現程序性死亡，Perthes病發生，進一步加重了局部的缺血缺氧，進一步誘導p53和Bcl-2凋亡相關基因的異常表達造成骨細胞的進一步凋亡和壞死。本實驗結果證實經股骨頸注射建立Perthes病模型引起股骨頭局部缺血改變，局部骨內壓升高，與各種原因引起的股骨頭缺血，組織水腫基本一致，股骨頭內局部血液循環障礙引起內壓增高，反過來加重了組織缺血。持續的缺血，造成骨細胞正常代謝障礙，誘導了凋亡基因及凋亡抑制基因的異常表達，造成骨細胞持續性凋亡。如不能得到及時處理，隨著組織缺血缺氧進一步加重，組織水腫，骨內壓持續性升高，進一步造成血液循環障礙，誘導Bcl-2凋亡抑制基因表達進一步減少， p53凋亡誘導基因異常增加，股骨頭關節軟骨，骺軟骨細胞持續性的凋亡及壞死，引起Perthes病發生。

因此，通過應用TH膠注射建立兒童股骨頭壞死動物模型，造成股骨頭微血栓形成，細胞缺血，組織水腫，骨內壓增加，兒童股骨頭壞死模型建立，異常的骨內微環境又誘導了p53 、Bcl-2等凋亡相關基因表達的變化，加速了骨細胞的凋亡，他們是Perthes病發生的并發因素并加速Perthes病的發生。本實驗的研究對于Perthes病的發病機理進一步闡述，對該疾病的深入研究提供了理論支持。如何降低Perthes病股骨頭內壓力及抑制凋亡基因發生變化，降低股骨頭壞死率仍需進一步研究。

參考文獻

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(收稿：2015-07-17)

Establishment of rabbit Perthes disease model and expression of p53 and Bcl-2 of the caput femoris

Fourth People’s Hospital of Shaanxi Province(Xi’an 710043)

Zhang Yabin Yao Yongfeng Pang Zhonghui

ABSTRACTObjective:To establish Perthes disease animal model to observe the changes of apoptosis gene that related to the caput femoris. Methods:32 New Zealand rabbit were randomly divided into experimental group and control group, and in the experimental group (group A), 0.5 ml medical TH glue was injected into the right side of the caput femoris under perspective through the collum femoris, 0.5 ml normal saline was injected to the control group with the same method. After the establishment of the model, the right side of the caput femoris in both groups were observed to see the apoptosis gene expression changes of p53 and BCL-2 of caput femoris in the 6th,8th,10th and 12th week. Results: After six weeks modeling, group A's hip joint gap widened, petechial hemorrhage could be seen. As the extension of the experimental phase degeneration area expanded gradually, the p53 gene expression of femoral epiphyseal plate had positive correlation with apoptosis rate, and the positive rate of BCL-2 gene expression was negative related to apoptosis. There was no obvious abnormality in the caput femoris of group B. Conclusion: It is stabile and has no reversal to establish the Perthes disease animal model via the injection of medical TH glue perthes through femoral neck, and the operation is simple. The correlation between p53 and BCL-2 and Perthes disease is confirmed.

KEY WORDSFemur head necrosisGenes,p53Genes,Bcl-2Models,animalApoprosisRabbits

【中圖分類號】R392.3

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.03.003

*陜西省科學技術研究發展計劃項目(S2012SF2889)