柴胡注射液對人肝癌細胞株SMMC-7721增殖及凋亡的影響*

延安大學醫學院(延安 716000)

劉曉斌　張正祥　吉金山　張欠欠　艾彩蓮　劉　燁△　惠起源△

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柴胡注射液對人肝癌細胞株SMMC-7721增殖及凋亡的影響*

延安大學醫學院(延安 716000)

劉曉斌張正祥吉金山張欠欠艾彩蓮劉燁△惠起源△

摘要目的：探討柴胡注射液對人肝癌細胞株SMMC-7721凋亡的影響及相關機制。方法：將人肝癌SMMC-7721細胞株(由西安交通大學醫學院第一附屬醫院臨床分子試驗中心提供)分為空白對照組(加10%小牛血清的1640培養液)、氟尿嘧啶陽性對照組(10μg/ml)及實驗組(分別為5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml柴胡注射液)。采用噻唑藍比色法(即MTT)檢測人肝癌細胞株SMMC-7721對柴胡注射液藥物和氟尿嘧啶注射液的敏感性；應用流式細胞術(FCM)檢測柴胡注射液對人肝癌細胞株(SMMC-7721細胞)周期的影響。結果：柴胡注射液對SMMC-7721的生長有明顯的抑制作用，抑制率與柴胡注射液濃度呈正相關。不同濃度柴胡注射液處理肝癌細胞時，藥物濃度與凋亡細胞且呈劑量依賴關系。結論：柴胡提取物可抑制人肝癌SMMC-7721細胞增殖，誘導其凋亡，作用機制可能與調控細胞周期有關。

主題詞肝腫瘤，實驗性細胞增殖細胞凋亡柴胡注射液

目前，對于中、晚期肝癌患者的治療，根據病情采用中醫中藥治療、放療、化療、冷凍、肝動脈栓塞化療等多種方法, 但療效均不理想。研究表明,柴胡可通過保護肝細胞、殺傷或抑制細胞增殖的肝癌、誘導肝癌細胞凋亡、提高機體免疫力以及逆轉肝癌細胞耐藥等發揮抗肝癌作用[1]。本研究以人肝癌SMMC-7721細胞為實驗對象，研究柴胡注射液對肝癌細胞凋亡和增殖的影響，分析柴胡注射液對癌細胞周期的影響。

資料與方法

1 材料

1.1 細胞株：人肝癌SMMC-7721細胞株由西安交通大學醫學院第一附屬醫院臨床分子試驗中心提供。該細胞株在含10%小牛血清的RPMI 1640培養基中呈單層生長，維持培養于37℃、5%CO2、95%空氣濕度的培養箱中。3～5d傳代一次，傳代時將原配養液吸出，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化1min，然后加入6ml新培養液終止消化，繼而用培養液吹打制成細胞懸液傳代或接種。

1.2試劑及主要儀器： 柴胡注射液由河南淅川制藥廠生產；RPMI1640 培養基購自GIBCO公司；胰蛋白酶干粉(批號:810214)、酚紅(批號: 831008)：上海化學試劑廠生產；小牛血清：武漢三利生物技術有限公司生產；噻唑藍(MTT)、 二甲基亞砜(DMSO)：均購自美國SIGMA公司；氟尿嘧啶注射液：北京北大藥業有限公司生產(GMP)； 流式細胞儀(型號:calber)：BD公司生產；酶聯檢測分析儀(型號-680)：美國伯樂。

2方法

2.1樣品液配制及實驗分組

2.1.1小牛血清(100ml/瓶)：-20℃冰箱保存, 將小牛血清在56℃水浴中滅活(30min)后按1∶ 9的比例加入培養液，制成10%的小牛血清培養液。

2.1.2 0.25%胰蛋白酶溶液：準確稱取胰蛋白酶干粉0.25g，溶于RPMI 1640培養液中，稀釋至100ml，攪拌均勻后，保存于4℃冰箱，過夜后超凈臺抽濾除菌，取樣做無菌試驗，然后-20℃冰箱保存備用。

2.1.3PBS干液(10×PBS，pH7.2)：KCl 0.2g，NaCl 9.0g， KH2PO40.27g，NaH2PO4·12H2O2.85g，雙蒸水100ml在振蕩器上充分混勻，4℃保存備用。

2.1.4PBS工作液(1×PBS)：PBS干液50ml、雙蒸水450ml充分混勻分裝，103.4kPa(121.3℃)滅菌15min，4℃保存備用。

2.1.5MTT液： PBS工作液配成5mg/ml過濾除菌，避光-20℃保存備用。

2.1.6 柴胡注射液實驗組：將柴胡注射液(每ml含生藥1g)溶于1640培養液中，分別制成5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml五組濃度梯度，并過濾除菌，于4℃保存備用。

2.1.7陽性對照組：用滅菌生理鹽水將5-氟尿嘧啶(5-Fu)注射液稀釋成10μg/ml濃度，過濾除菌，4℃保存備用。

2.1.8陰性對照組：加入與實驗組相同體積的完全培養液。

2.1.9 空白對照組：加入與實驗組相同體積的完全培養液。

2.2 檢測方法與統計學方法： 采用噻唑藍比色法(MTT)檢測人肝癌SMMC-7721細胞株對不同濃度柴胡注射液藥物和氟尿嘧啶注射液的敏感性，用流式細胞術( FCM) 檢測不同濃度柴胡注射液藥物和氟尿嘧啶注射液對人肝癌SMMC-7721細胞株周期的影響。運用SPSS17．0統計學軟件，計量資料采用t檢驗，α=0.05(雙側)作為檢驗標準；計數資料應用Fisher確切概率法進行統計分析。

結果

1柴胡注射液對人肝癌SMMC-7721細胞株增殖的抑制柴胡注射液可抑制SMMC-7721細胞，抑制率隨柴胡注射液濃度的升高而增加；其中，濃度為50mg/ml柴胡注射液組對SMMC-7721細胞的抑制率為49.82%，接近半數抑制率。柴胡注射液5mg/ml組與陰性對照組比較差異無統計學意義，25mg/ml柴胡注射液組與陽性對照組比較差異無統計學意義，其余各組間比較，差異有統計學意義,見表1、2。

表1　柴胡注射液實驗組、陰性、陽性對照組及空白組OD值

表2　各組對SMMC-7721細胞活性及功能狀態影響

注：抑制率=(對照組OD-實驗組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%

2流式細胞儀檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的細胞周期柴胡注射液對SMMC-7721細胞作用12h后，經流式細胞術檢測不同濃度柴胡注射液對SMMC-7721細胞周期的影響，結果顯示經柴胡注射液作用后的的肝癌細胞株G1期細胞的百分比不斷減少,見表3。

3流式細胞儀檢測SMMC-7721細胞凋亡率未用藥時，凋亡細胞僅占2.32%，并且未出現凋亡峰。而當用5mg/ml、10mg/ml、25mg/ml、50mg/ml柴胡注射液處理細胞12h后均出現了凋亡峰，凋亡細胞分別占總細胞數的13.62%、15.32%、23.32%、30.42%，隨著藥物濃度的增大凋亡率也增大，且呈劑量依賴關系。

表3　不同濃度柴胡注射液對SMMC-7721

討論

茅敏等[2]通過體內實驗得出小柴胡湯抗腫瘤的作用機制一方面可能與其誘導腫瘤細胞凋亡有關，另一方面可影響腫瘤細胞周期，造成其增殖指數降低，從而在一定程度上控制了腫瘤的增殖。喬喜婷等報道[3],柴胡主要活性成份柴胡皂苷具有對抗多種因素導致的肝損傷和肝纖維化的作用。細胞死亡是由正常的細胞周期改變而引起，細胞凋亡與細胞周期阻滯有關，細胞阻滯于哪一期，凋亡就發生在哪一期。本實驗研究顯示，隨柴胡注射液劑量增加，G1期SMMC-7721細胞比率不斷減少，且呈劑量依賴性，而柴胡注射液對SMMC-7721細胞的抑制也呈劑量依賴性，表明柴胡注射液可能阻滯SMMC-7721細胞于G1期，并且通過誘導期凋亡而產生抗腫瘤作用。

王艷麗等[4]的MTT法測定結果顯示：SSd(柴胡皂d)對肝癌SMMC-7721細胞株的增殖有明顯的抑制作用，隨著SSd作用濃度和時間的變化而改變，在一定的范圍內呈明顯的劑量和時間依賴性。胡淑婷[5]等報道結果顯示與對照組比較，實驗組細胞的生長受到明顯抑制，差異均有統計學意義。本實驗研究顯示柴胡注射液處理SMMC-7721細胞株后，活細胞數目減少，癌細胞功能受抑制，抑制率隨濃度的升高而增加。當柴胡注射液濃度為50mg/ml時，對SMMC-7721細胞的抑制率(49.82%)接近半數抑制率；而且當柴胡注液濃度達到25mg/ml時, 其抑制率與氟尿嘧啶10μg/ml對照組的抑制率相差無幾，這一結果與唐婷婷[1]等報道結果相一致。

流式細胞術是近年來廣泛用于腫瘤細胞診斷及細胞動力學等領域的新技術，它通過DNA含量分析細胞周期分布，從而反映腫瘤細胞的增殖狀態。本研究結果顯示，經柴胡注射液作用后的肝癌細胞株G1期細胞的百分比不斷減少，說明人肝癌細胞株SMMC-7721主要被抑制在Gl期。同時顯示未用藥時，凋亡細胞僅占2.32%，并且未出現凋亡峰；而當用不同濃度柴胡注射液處理細胞12h后均出現了凋亡峰，并且隨著藥物濃度的增大凋亡率也增大，呈劑量依賴關系。

可見，柴胡注射液中的有效成分可抑制人肝癌細胞SMMC-7721的增殖，誘導肝癌細胞凋亡。但不同學者報道的柴胡注射液對SMMC-7721的量效關系結果不完全相同，表明在肝癌的治療中運用柴胡需足量，其制劑用于治療肝癌時則需對有效成分進行精提取。

參考文獻

[1]唐婷婷, 施貝德.柴胡注射液抑制人肝癌細胞株HepG2增殖的實驗研究[J].亞太傳統醫藥,2011,7(5):27-29.

[2]茅敏,付虹,黃秀深,等.小柴胡湯誘導荷瘤小鼠S180細胞凋亡及對細胞周期的影響[J].現代中西醫結合雜志,2005,14(20):2646-2648.

[3]喬喜婷，王克窮，代引海，等.小柴胡湯聯合肝動脈化療栓塞術治療原發性肝癌的臨床觀察[J].陜西中醫，2014，35(7)：835-836.

[4]王艷麗,和水祥,羅金燕,等.柴胡皂甙對肝癌SMMC-7721細胞增殖的抑制作用[J].西安交通大學學報(醫學版),2006,27(6):572-574.

[5]胡淑婷,奧海航,王英華,等.小葉黑柴胡誘導人胃腺癌MGC-803細胞凋亡的實驗研究[J].寧夏醫學院學報,2007,29(1):13-16.

(收稿：2015-03-23)

Effect of radix bupleuri injuction on hunman hepatic carcinoma cells' proliferation and apoptosis

The Medical College of Yan'an University(Yan'an 716000)

Liu XiaobinZhang Zhenxiang Ji Jinshanet al

ABSTRACTObjective: To investigate the effect of bupleurum injection on human hepatic carcinoma cells'(SMMC-7721) apoptosis and related mechanisms. Methods: With different concentrations (0, 5, 10, 20, 25, 50mg/ml) treatment liver cancer SMMC-7721 cell line, determined by MTT method in different concentrations of tumor cells after treated by inhibiting rate; FCM detect different concentrations of radix bupleuri injection effect on SMMC-7721 cell cycle. Results: Different concentrations of radix bupleuri injection processing SMMC-7721 cell, number of living cells, cancer cells function inhibition, inhibition rate and radix bupleuri injection concentration were positively correlated, when the concentration of radix bupleuri injection of 50mg/ml, inhibition rate reached the maximum. Radix bupleuri injection 5mg/ml, 10mg/ml, 25mg/ml, 50mg/ml dealing with cells, apoptosis cells respectively accounted for 13.62%, 15.32%, 23.32%, 30.42% of the total, apoptosis rate increased with the increase of drug concentration, and a dose-response relationship. Conclusion: Bupleurum extract can inhibits human hepatic carcinoma SMMC-7721 cells' proliferation, induce its apoptosis, and the mechanism of action may be related to the regulation of cell cycle.

KEY WORDSLiver neoplasms,experimentalCell proliferationApoptosisChai hu zhu she ye

【中圖分類號】R392.5

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.03.008

*陜西省教育廳專項科研基金項目(11JK0669)

△延安大學附屬醫院