肝脂肪酶基因-514C/T多態性與陜西地區非酒精性脂肪肝人群關系研究*

西安市第四醫院(西安 710004)

楊利萍　江　梅△　李　汀　樊英華　常遠鴻　陰　俊　王曉玲　郭　佳　王君化

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肝脂肪酶基因-514C/T多態性與陜西地區非酒精性脂肪肝人群關系研究*

西安市第四醫院(西安 710004)

楊利萍江梅△李汀樊英華常遠鴻陰俊王曉玲郭佳王君化

摘要目的：比較陜西地區人群中非酒精性脂肪肝(NAFLD)患者與正常人群肝脂肪酶(HLG)-514C/T多態性分布差異，探討其與NAFLD發病易感性關系。方法：選取NAFLD患者96例及正常對照組98例，用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行基因多態位點檢測HLG-514位點基因型,并測量其體重指數、腰臀比、血壓、膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、空腹血糖指數。結果：正常對照組HLG-514 CC、CT、TT基因型分別是26.5%、59.2%、14.2%，NAFLD組31.3%、63.5%、5.2%，兩組CC基因型頻率和C等位基因頻率比較有統計學差異。結論：肝脂肪酶-514C/T以雜合子C/T基因型所占的百分比高，其基因多態性與陜西NAFLD患者發病有關。

主題詞非酒精性脂肪肝擴增片段長度多態性分析多態現象，單核苷酸脂肪酶/分析

非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種與代謝綜合征、胰島素抵抗(Insulin resistance， IR)和遺傳易感性密切相關的代謝應激性肝損傷，疾病譜包括單純性脂肪肝(Simple fatty live，SFL)、脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis， NASH)及其相關肝硬化和肝細胞癌(Hepatocellular cellular,HCC)。NAFLD除直接或通過促進并存的其他肝病進展，導致肝功能衰竭、HCC和移植肝復發外，還參與2型糖尿病和動脈粥樣硬化的發病。其發病主要與胰島素抵抗和遺傳易感有關[1]。肝脂肪酶是肝臟特有的調節肝內脂質代謝的關鍵酶，研究發現，肝脂肪酶基因(Hepatic lipase gene ,HLG)啟動子區-514位點基因多態性與肝脂肪酶活性、血脂異常和IR相關[2]。本研究通過對比陜西地區NAFLD患者與健康人群中HLG-514位點基因型的分布情況，研究HLG-514位點不同基因型與NAFLD易感性的關系。

資料和方法

1一般資料選取2012年8月至2013年7月在陜西地區西安市第四醫院、安康市第一人民醫院、延安醫學院第一附屬醫院住院、門診及體檢中心經臨床和影像學診斷為NAFLD的患者96例作為研究組，其中男性46例，女性50例，平均年齡45歲。另選取同期同地健康體檢者98例作為對照組，其中男性47例，女性51例，平均年齡44歲。兩組對象進行問卷調查、體格檢查、血清學檢查和肝臟超聲檢查，進行脂肪肝流行病學調查。NAFLD診斷標準符合《非酒精性脂肪性肝病診療指南》標準[3]。剔除標準包括：患各型病毒性肝炎、肝硬化、近期服用肝損害藥物及影響血脂代謝的藥物、惡性腫瘤等疾病；乙醇攝入量>40g/周或近2周內有大量飲酒史；一級親屬中有2型糖尿病、高血壓、高脂血癥及其他代謝性疾病者。按性別、年齡、戶籍地配對選取相同數量正常人作為對照組。研究對象年齡、性別等一般資料與對照組健康志愿者相比無統計學意義(P>0.05)。

2研究方法于清晨空腹狀態行肝臟B超檢查、測量身高、體重、血壓、臀圍、腰圍。計算體重指數和腰臀比，采靜脈血10ml，其中5ml用于檢測空腹血糖、肝功、血脂及肝炎病毒血清學檢查，另5ml采用改進的苯酚-氯仿提取方法提取基因組DNA，-20°C保存備用，取DNA樣品2μl進行瓊脂糖檢測符合要求。

2.1引物設計及擴增：NCBI上確定位點序列，采用引物設計軟件Primer Premier5進行引物設計(由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成)，并進行引物擴增，選擇擴增條帶單一、特異性好的引物進行試驗；上游引物5‘-CAGAGGGGGAAGAAGTGTGT-3’，下游引物5‘-GGTGATGCTTGTGGTCAAAG-3’，擴增片段為139bp，梯度PCR擴增后確定最佳退火溫度為61°C，94°C預變性5min，94°C變性50s，61°C退火40s，72°C延伸40s，72°C延伸10min，共34個循環。

2.2PCR產物檢測：取5μlPCR產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統檢測。

2.3非變性聚丙烯酰胺電泳進行基因多態位點檢測：清洗玻板、膠條、烘干，將玻板固定，配制非變性聚丙烯酰胺凝膠，插入梳子，室溫下聚合2h左右，4°C冰箱放置過夜，凝膠聚合后，拔出梳齒，取PCR產物置于PCR管中，離心混勻，變形后冰浴，上樣，然后電泳，銀染聚丙烯酰胺凝膠，觀察結果并拍照保存。

2.4測序驗證試驗結果：根據非變性聚丙烯酰胺電泳及檢測結果選取HLG基因樣本，寄送至北京三博遠志生物技術有限責任公司進行測序驗證，確定HLG-514基因型。

3統計學方法等位基因頻率=(純合子例數X2+雜合子例數)/(2X總例數);統計學分析采用Hardy-Weinberg定律、連鎖不平衡分析、等位基因頻率和基因型分布用計數資料表示。

結果

對194份DNA(98名健康對照、96例NAFLD患者)進行基因型分析，發現在NAFLD與正常組中， TT基因型的分布頻率分別為5.2%和14.2%，CT基因型分布頻率分別為63.5%和59.2%， CC基因型分布頻率分別為31.3%和26.5%，兩組比較有統計學差異(P<0.05)。經Hardy-Weinberg平衡檢驗，兩組間等位基因頻率也有統計學差異(P<0.05)，見附表。

附表　HLG-514基因多態性基因型

討論

國外研究認為NAFLD的發病與個體及多種社會因素密切相關，不同種族、地域、體質的人群發病的危險因素各有特點，預防措施存在差異。近年來，隨著飲食結構和生活習慣的改變，我國特別是城市地區的NAFLD的發病率明顯上升。盡管目前我國有一些NAFLD的流行病學調查，但絕大部分是基于特殊的職業人群或醫院，而針對普通人群的調查較少，僅見上海市有以普通城市人群相關NAFLD流行病學調查報告，但仍缺乏對于陜西省城市地區普通人群NAFLD流行病學研究。

近年來，有研究認為某些調節肝臟脂肪代謝的基因與NAFLD的發病及發展有著密切關系，相關基因的多態性與NAFLD的關系也有研究報道，但目前國內都僅限于小樣本的研究，尚缺乏大樣本、多中心的研究。

Saibara等用PCR檢測95例NASH患者等位基因A2217G的多態性，發現G/G純合子組易出現肝細胞氣球樣變且年齡輕，提示遺傳因素參與NASH發病。國內周永健[4-5]等研究發現脂肪細胞因子如脂聯素、過氧化物酶體增殖因子活化受體-γ(PPAR-γ)、 肝脂肪酶基因(Hepatic lipase gene，HLG)啟動子區-514位點基因多態性與肝脂肪酶活性、血脂異常和IR相關、以及磷脂中磷脂酰膽堿磷脂酰乙醇胺N - 甲基轉移酶( PEMT)與NAFLD的發生與發展相關。

肝脂肪酶是由肝臟特異性合成并表達的調節肝臟脂質蛋白代謝的關鍵酶。肝脂肪酶選擇性分解脂蛋白中的甘油三酯和磷脂，還可與脂蛋白結合，參與脂蛋白的跨膜轉運[6]。其活性與內臟脂肪含量呈正相關。研究發現肝脂肪酶活性受多因素調控，其中HLG啟動子區-514位點基因多態性與肝脂肪酶活性的關系密切，對細胞株的瞬時轉染實驗發現，HLG-514T變異可使HLG轉錄活性下降約30%，使肝脂肪酶活性降低[7]。我們的研究發現，野生純合子(CC型)NAFLD發病的易感性明顯高于T等位基因攜帶者，HLG-514變異可令NAFLD發病易感性降低。對比不同種族間各基因型頻率和等位基因頻率的差異，發現華人與韓國人及美國黑種人T等位基因頻率接近，均高于美國白種人，這種基因分布的差異與美國黑人非酒精性脂肪肝發病率較白人低的情況一致[8-10]。

我們通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法對98名正常人，96例NAFLD患者的HLG-514啟動子區位點的多態性進行了檢測，發現該多態性位點的CT基因型在NAFLD人群中(63.5%)高于正常對照組(59.2%)，CC基因型在NAFLD患者中(31.3%)高于健康對照者(26.5%)，有統計學差異，提示HLG啟動子區-514基因與陜西省NAFLD患者有關。但我們在NAFLD患者中進行基因多態性的研究，僅對陜西省漢族人進行了分析，樣本例數相對較少，對HLG-基因多態性與NAFLD發病的關系尚需大樣本、多地域、多民族廣泛深入協同研究。

參考文獻

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[2]Tai ES，Corella D，Deurenberg-Yap M，etal．Dietary fat interacts with the-514C>T polymorphism in the hepatic lipase gene promoter on plasma lipid profiles in a multiethnic Asian population：the 1998 Singapore National Health Survey[J]．Nutr，2003，133：3399-3408.

[3]中華醫學會肝臟病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組. 非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010修訂版)[J].胃腸病學和肝病學雜志，2010，19(6)：483-487.

[4]周永健，李瑜元. 過氧化物酶體增殖因子活化受體-基因多態性與非酒精性脂肪性肝病及脂聯素的關系[J]. 中華消化雜志，2006，26(5)： 311-314.

[5]石勝利，周永健. 脂聯素基因Gly15Gly多態性與非酒精性脂肪肝病的關系[J]. 廣州醫學院學報，2005，33(6)：1-3.

[6]Zambon A，Deeb SS，Bensadoun A，etal．In vivo evidence of a rolefor hepatic lipase in human apoB-containing lipoprotein metabolism，independent of its lipolytic activity[J]．J Lipid Res，2000，41：2094-2099．

[7]Deeb SS，Peng R. The C-514T polymorphism in the human hepatic lipase gene promoter diminishes its activity[J]．J Lipid Res，2000，41：155-158．

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[9]Shargorodsky M，Omelehenko E，Matas Z，etal．Relationbetween augmentation index and adiponectin du6ng one year metformin treatment for nonalcoholic steatohepatosis：Effects beyond glucose lowering[J]．Cardiovasc Diabetol，2012，11：61-68．

[10]Hong SH，Song J，Kim JQ．Genetic variations of the hepatic lipasegene in Korean patien with coronary artery disease[J]．Clin Biochem，2012，33：291-296．

(收稿：2015-03-04)

Association of hepatic lipase gene promoter polymorphism -514C/T with nonalcoholic fatty liver disease of Shanxi

The No.4 Hospital of Xi’an( Xi’an710004)

Yang LipingJiang MeiLi Tinget al

ABSTRACTObjective: To study the prevalence of the hepatic lipase gene (LIPC) promoter polymorphism(at position -514)in patients of Shanxi with nonalcoholic fatty live disease(NAFLD)，and its relationship with the susceptibility to NAFLD. Methods: Genotype of LIPC promoter was detected with non-denaturant polyacrylamide gel electrophoresis in 96 patients with NAFLD and 98 of normal control．Body mass index，waist-to-hip ratio(WHR)，blood pressure, CHOL, HDL, LDL,TG and FPG of the patients were measured. Results: The proportions of genotypes of CC、CT and TT at -514 of LIPC in healthy people were26.5%、59.2%、14.2%，respectively, whereas those in patients with NAFLD were 31.3%、63.5%、5.2%, The frequency of CC genotype and C allele in the NAFLD group were significantly higher than those in the control group. Conclusion:The proportions of genotypes of C/T are dominant at -514 of LIPC in patients with NAFLD and controls. Gene polymorphism of LIPC-5 14C/T is correlated with susceptibility to NAFLD of Shanxi.

KEY WORDSNon-alcoholic fatty liver diseaseAmplified fragment length polymorphism analysisPolymorphism, single nucleotideLipase/analysis

【中圖分類號】R575.5

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.03.015

*陜西省自然科學基礎研究計劃重點項目(2011JM4036)

△通訊作者