沼澤紅假單胞菌16SrDNA PCR快速檢測方法研究

王妍力，耿亞亞，郝葆青（西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都610041）

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沼澤紅假單胞菌16SrDNA PCR快速檢測方法研究

王妍力，耿亞亞，郝葆青*
（西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都610041）

摘要：目的：依據(jù)反映光合菌物種屬性和高度保守性的16S rDNA序列，設計其特異性引物，優(yōu)化并確定PCR反應條件，探索沼澤紅假單胞菌快速鑒別的方法。方法：提取沼澤紅假單胞菌菌體染色體DNA，分離和純化；從GenBank分別獲取假單胞菌屬、大腸桿菌和諾卡氏菌屬的16S rDNA基因序列，分析比較并確定其可變區(qū)的基因序列片段，設計種屬特異引物；對影響PCR擴增的因素進行分析和預試，確定PCR擴增的最佳條件；隨后進行PCR擴增試驗，對其產(chǎn)物克隆測序，同時進行沼澤紅假單胞菌形態(tài)特征和生化特性的檢測。結論：以16S rDNA的種屬特征序列設計引物，PCR擴增檢測沼澤紅假單胞菌樣本的方法，特異強、靈敏度高、重復性好、操作性強、價格低廉；從分離提取樣本DNA到完成PCR擴增，可在3h左右對沼澤紅假單胞菌作出鑒定。

關鍵詞：沼澤紅假單胞菌；16S rDNA；引物；PCR擴增；條件優(yōu)化；諾卡氏菌屬

按照《伯杰細菌鑒定手冊》［1］分類，光合細菌分為45種，沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）屬于光合細菌分類中的紅螺菌科、紅假單胞菌屬。沼澤紅假單胞菌廣泛存在于自然界，具有原始光能合成體系，可在厭氧光照或好氧黑暗條件下利用自然界中的有機物、硫化物、氨等進行光合作用［2-4］。沼澤紅假單胞菌因具有復雜而多樣化的代謝功能等特性，可產(chǎn)生豐富的營養(yǎng)和生理活性物質(zhì)，已廣泛地應用于農(nóng)業(yè)、漁業(yè)、環(huán)保、醫(yī)藥等領域。以沼澤紅假單胞菌為菌種生產(chǎn)的微生物肥料產(chǎn)品在水稻、蔬菜、果樹和煙草等作物上都取得了較好的效果［5-7］。研究表明，該類光合細菌具有改善土壤結構與營養(yǎng)狀況、提高作物抗病防病能力、提高作物的光合作用和作物品質(zhì)等功效［8-8］。近年來沼澤紅假單胞菌在各行各業(yè)的應用迅速增加，其質(zhì)量和數(shù)量是確保相關產(chǎn)品安全有效的關鍵，因此，建立該菌的快速檢測技術是很重要的。

本文針對原核生物16S rDNA堿基序列具有保守性、不易受環(huán)境變化影響等特性，將假單胞菌屬中10種菌的16S rDNA序列與大腸桿菌和諾卡氏菌屬（Nocardiopsis sp）的16S rDNA序列作對比，選擇其差異性顯著的堿基序列片段進行引物設計，以此來探索沼澤紅假單胞菌的快速檢測方法。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌種沼澤紅假單胞菌菌株由西南民大生命科學與技術學院細胞生物實驗室提供，大腸埃希氏桿菌菌株AB80054由該學院微生物實驗室提供。

1.1.2培養(yǎng)基與試劑基礎培養(yǎng)基：酵母膏3.0 g，蛋白胨5 g，瓊脂8 g，氯化鈉2.0 g，硫酸鎂0.5 g，蒸餾水1000mL，pH值6.8，121℃滅菌20min［6］。

沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)基（富集培養(yǎng)液）：乙酸鈉3.0g、丙酸鈉0.3g、NaCl 1.0g、（NH4）2SO40.3g、MgSO40.2g、KH2PO40.5g、K2HPO40.3g、CaCl250mg、MnSO42.5mg、FeSO45 mg、酵母膏0.1 g、蛋白胨10mg、谷氨酸0.2mg、蒸餾水1000mL，pH值7.4，121℃滅菌30min。若配制固體培養(yǎng)基則需再加入17g瓊脂，滅菌、制平板。

其他試劑：Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程公司生產(chǎn)）、TAE，2×Taq PCR MasterMix PR080530購自成都天根生物試劑公司。

1.2試驗方法

1.2.1菌株的富集與純化取試樣沼澤紅假單胞菌2mL于5mL試管中，塞緊，30℃、2000 Lx光照、厭氧條件下培養(yǎng)48h。菌落計數(shù)，以確定原菌液濃度。

采用涂布法對試樣菌進行分離純化：取0.1mL試樣菌液進行過濾除雜，采用富集培養(yǎng)液稀釋至1mL，重復過濾操作3次，用移液槍吸取0.1mL接種于平板培養(yǎng)基上，涂勻。待30 min菌液滲透進平板后，用基礎培養(yǎng)基覆蓋以造成厭氧環(huán)境，用封口膠把平板密封好放入光照培養(yǎng)箱中30℃、2 000 Lx光照下培養(yǎng)24～48h。然后挑選紅色單個菌落接種于裝有25mL富集培養(yǎng)液的三角培養(yǎng)瓶中，并在上述同樣條件下培養(yǎng)7～8d，直至整個培養(yǎng)液變紅色或紅褐色，即得純種菌株，取名S1菌株。菌落計數(shù)，確定其菌液濃度。4℃保存?zhèn)溆茫杀４?周）。

1.2.2菌落及菌體的形態(tài)觀察挑取平板培養(yǎng)的S1菌株的單個紅色菌落，革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌落形態(tài)特征、染色狀態(tài)。參照《伯杰細菌鑒定手冊》［1］進行形態(tài)學鑒定。

1.2.3沼澤紅假單胞菌DNA的提取取1mL過夜培養(yǎng)的S1菌液于1.5mL離心管中，室溫8000r/min離心1min，棄上清，收集菌體。加入180μL Buffer Digestion（BD），再加入20 μL Proteinase K溶液，振蕩混勻，56℃水浴1h至細胞完全裂解。加入200μL BD液，充分點到混勻。再加入200μL無水乙醇，充分點到混勻。將吸附柱放于收集管中，用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加入吸附柱中，靜置2min，再12000r/min室溫離心1min，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱放回收集管，加入500 μL PW Solution，10000r/min離心30s倒掉濾液。再將吸附柱放回收集管，加入500μL Wash Solution，10000r/min離心30 s倒掉濾液。又將吸附柱重新放回收集管中，12 000 r/min室溫離心2 min，離去殘留的Wash Solution。取出吸附柱，放入一個新的1.5mL離心管中，加入70μL CE Butter，靜置3min，12000r/min室溫離心2min，收集DNA溶液。-20℃保存。

1.2.4引物設計由GenBank選取沼澤紅假單胞菌屬及其相近屬共10種16S rDNA基因序列，利用DNAMAN軟件將它們分別與大腸桿菌和諾卡氏菌屬的16S rDNA序列作比較分析，確定和定位其可變區(qū)的基因序列片段。用引物設計軟件Primer 5在定位區(qū)域設計引物，引物合成由成都華達科技公司完成。

1.2.5PCR擴增條件的優(yōu)化采用上述引物，以S1菌株染色體DNA為模板分別進行PCR反應時間和溫度等條件的優(yōu)化。在25μL反應體系中，分別設置不同的4個時間梯度水平和溫度梯度水平進行PCR擴增反應循環(huán)試驗，方法參見肖亦農(nóng)等［11］。根據(jù)不同時間和溫度組合的PCR反應結果，確定出現(xiàn)目的條帶最清晰的時間和溫度最優(yōu)組合。

1.2.6擴增及產(chǎn)物回收選取PCR反應的最佳條件進行擴增試驗，擴增反應采用25μL體系：DNA模板1μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，2×Taq Master-Mix 12.5μL，ddH2O 8.8μL。反應程序（最佳擴增條件）：85℃3min，84℃20s、65℃20s、72℃1min（共35個循環(huán)），72℃8min。

反應所得產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀察，PCR Fragment Recovery Kit回收，并送往成都華達科技公司測序。

2　結果與分析

2.1富集培養(yǎng)特征將S1菌株的試樣菌液接種于富集培養(yǎng)液中培養(yǎng)，第3d可以明顯觀察到菌液出現(xiàn)白色渾濁的絮狀沉淀；第5d就可以觀察到菌液呈現(xiàn)淺紅色。每隔24h振蕩晃動一次，經(jīng)過2～3次的轉富集培養(yǎng)，就可以見到明顯的淺紅色或紅褐色菌液。

2.2菌株鏡檢該菌液呈深紅色，黑暗好氧培養(yǎng)后呈淺紅色，平板上單菌落在單層平板上呈乳白色，燈光下呈橘紅色。陰性菌革蘭氏染色后呈紅色，陽性菌呈紫色。厭氧培養(yǎng)條件下，固定平板上該菌落為棕紅色，菌落呈凸起狀，表面光滑、濕潤、有光澤，邊緣整齊。該菌經(jīng)革蘭氏染色、鏡檢，結果為陰性菌，形態(tài)呈短桿狀或卵形兩端鈍圓。

2.3引物設計選取沼澤紅假單胞菌S1菌株與假單胞菌屬的另外10種菌株的基因序列（從GenBank獲取），運用Mega5.0構建進化樹，結果顯示它們的同源性平均都在88%以上。采用BLAST程序將沼澤紅假單胞菌株的16S rDNA序列分別與大腸桿菌、諾卡氏菌屬的16S rDNA序列進行相似性分析，結果顯示它們的同源性較低，其差異性序列即為沼澤紅假單胞菌的種屬特征基因片段。以此設計引物：上游引物F序列為5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇，下游引物R序列為5＇-AAGGAGGTGATCCAGCC-3＇。2.4 PCR擴增條件的優(yōu)化聚合酶鏈式反應（PCR）雖然具有很高的特異性和敏感性，但由于反應條件不合適，仍然有假陽性。PCR擴增反應循環(huán)設置見圖1。在圖1中，①采用肖亦農(nóng)等［11］的方法，為比照試驗；

圖1　PCR擴增條件優(yōu)化結果

②③④為PCR優(yōu)化條件試驗。試驗結果表明，在擴增條件①②③中，其目的條帶不清晰，特異性不強，有雜帶。只有擴增條件④的條帶清晰，特異性強，故④為最優(yōu)化擴增條件。

2.5 PCR擴增對沼澤紅假單胞菌S1菌株的染色體DNA進行PCR擴增，用PCR Fragment Recovery Kit回收目的產(chǎn)物DNA片段，結果見圖2。對其產(chǎn)物DNA片段進行測序，結果顯示長度為1432bp。將該結果與沼澤紅假單胞菌及其菌屬的16S cDNA序列（1500bp）作比較，得出條帶大小相符。因此，可判定此S1菌株為沼澤紅假單胞菌。

圖2　菌株S1擴增產(chǎn)物電泳圖

3　討論與結論

在本實驗條件下，沼澤紅假單胞菌顯示了色彩、形態(tài)等方面的變化。厭氧光照培養(yǎng)，菌液由淡黃色渾濁絮狀沉淀逐漸變?yōu)榈t色，一周左右成為紅色或紅棕色培養(yǎng)物；好氧培養(yǎng)平板上，單菌落在單層平板上呈乳白色；厭氧培養(yǎng)菌落為棕紅色，并呈凸起狀，表面光滑、濕潤、有光澤，邊緣整齊；然后經(jīng)革蘭氏染色、鏡檢，結果為陰性菌，形態(tài)呈短桿狀或卵形兩端鈍圓。

同源性分析結果顯示，菌株S1與10種同屬菌株的同源性平均達到88%以上，與大腸桿菌和諾卡氏菌屬的同源性較低。由于16S rDNA序列具有保守性和存在的普遍性，以及核酸序列本身的穩(wěn)定性，進行同源性較低菌種間的16S rDNA序列比較，其差異性序列在沼澤紅假單胞菌種中的重現(xiàn)性極高，因此可將此序列作為該菌種鑒別的特征序列。采用這種16SrDNA中的特征序列進行擴增分析，結合形態(tài)鑒別的方法即可實現(xiàn)對沼澤紅假單胞菌快速、靈敏、微量、準確、簡便的檢測與鑒定。本方法具有獨特的優(yōu)點，特異性強、便于操作、重復性好。從分離純化樣本DNA到擴增產(chǎn)物的鑒別，只需3h左右即可完成，可最大程度地滿足光合細菌產(chǎn)品質(zhì)量檢測的準確性和時效性。

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Study on the Detection Method of Rhodopseudomonas Palustris with 16S rDNA PCR

WANG Yanli，GENG Yaya，HAO Baoqing*
（College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Sichuan Chengdu 610041，China）

Abstract：Objective：according to the species attributes and highly conservation of 16S rDNA sequence of photosynthetic bacteria，the specific primers were designed，and the PCR reaction conditions were optimized，in order to explore the identifying methods to Rhodopseudomonas palustris. Method：the chromosomal DNA was extracted from Rhodopseudomonas palustris cell，and it was isolated and purified. The 16S rDNA gene sequences of the Pseudomonas genus，Escherichia coil and Nocardiopsis sp came from the GenBank respectively，and the gene sequence fragments of variable region were analyzed and compared with each other for the design of the species-specific primers. Several factors that may affect the PCR amplification were analyzed，and also some pre-tests were done in order to determine the best conditions for the PCR amplification. And then the PCR amplification was done，the PCR products were cloned and sequenced. Meanwhile morphological and biochemical characteristics of Rhodopseudomonas palustris were tested. Conclusion：the method was developed to detect Rhodopseudomonas palustris by PCR amplification with species-specific primers，which had the properties of strong specificity，high sensitivity，good repeatability，high maneuverability and low price. The whole process from extracting the DNA to the PCR amplification was about 3h for identifying the strains of Rhodopseudomonas palustris.

Key words：Rhodopseudomonas palustris；16S rDNA；Primer；PCR amplification；Optimizing conditions；Nocardiopsis sp

中圖分類號：Q83-331，Q838.112

文獻標識碼：B

文章編號：1001-8864（2016）05-0020-02

收稿日期：2016-03-02

基金項目：西南民族大學研究生創(chuàng)新型科研項目（CX2015SP468）；四川省教改項目“獸醫(yī)專業(yè)學位研究生教育實踐基地建設”。

作者簡介：王妍力（1881-），女，四川成都人，獸醫(yī)碩士，研究方向：獸醫(yī)疾病預防。

*通訊作者：郝葆青（1856-），男，教授，博士。