中國新記錄種毛細木霉Trichoderma　capillare及功能評價

陳凱，李紀順，張廣志，王貽蓮，趙曉燕，吳曉青，扈進冬，楊合同

（山東省科學院生物研究所，山東省科學院生物技術研究中心，山東省應用微生物重點實驗室，山東　濟南　250014）

中國新記錄種毛細木霉Trichodermacapillare及功能評價

陳凱，李紀順，張廣志，王貽蓮，趙曉燕，吳曉青，扈進冬，楊合同*

（山東省科學院生物研究所，山東省科學院生物技術研究中心，山東省應用微生物重點實驗室，山東濟南250014）

摘要：木霉菌株TW22166分離自湖南省洞庭湖灘涂濕地，該菌株分生孢子梗具有長而發達的主軸，二次分枝豐富，不規則，一般單生，分生孢子梗向頂方向著生單個瓶梗。利用ITS、tef1及rpb2序列分析，發現該菌株同Trichodermacapillare同源性達到99%以上；在以rpb2構建的系統發育進化樹中，TW22166與TrichodermacapillarestrainGJS06-66［JN175530.1］位于同一分支。該菌株在PDA平板上對9種植物病原真菌均有抑制作用，其中對Fusarium.oxysporum的抑制率為100.0%。菌株具有蛋白酶、幾丁質酶及纖維素酶活性，其中蛋白酶活性較高，透明圈寬度達16.0mm。該菌株鑒定為毛細木霉Trichodermacapillare，是木霉屬中國新記錄種，也是一株較有潛力的生物防治菌株。

關鍵詞：中國新記錄種；毛細木霉；抑菌能力；水解酶活性

木霉屬TrichodermaPers.屬于半知菌亞門Deuteromycotina、絲孢綱Hyphomycetes、絲孢目Hyphomycetales的粘孢菌類Gloiosporae。現已證實其有性世代為子囊菌亞門Ascomycotina、肉座目Hypocreales、肉座科Hypocreaceae的肉座菌屬Hypocrea［1］。木霉是世界性分布真菌，主要存在于土壤、腐爛的木材及雜草中，因其在工業酶制劑、抗生素及生物防治等方面的應用價值而受到廣泛關注［2－3］。開展木霉屬資源和系統分類研究，將豐富對我國該類群物種多樣性的認識，不斷發掘和擴大有應用前景的物種資源，具有重要的經濟意義和學術價值。截止目前，國際上已報道木霉種類236種［4－8］，其中國內已發現的木霉種類為91種［9］，對其進行準確的分類和鑒定對于木霉的研究應用有重要意義。

本實驗室于2015年4月沿洞庭湖周邊灘涂濕地采集土樣和水樣，從69個樣品中，已分離到木霉菌株171株，對分離到的木霉進行了形態學和分子生物學序列分析，發現了1個中國新記錄種，即毛細木霉T.capillare。

1　材料與方法

1.1培養基

PDAm：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，鏈霉素0.1g，氯霉素0.3g，玫瑰紅0.02g，曲酮0.5mL，蒸餾水1000mL。

PDA：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL。

SNA：KH2PO41.0g，KNO31.0g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，葡萄糖0.2g，蔗糖0.2g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL。

CMD：玉米粉30g，葡萄糖20g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL。

幾丁質培養基：葡萄糖0.5g，MgSO4·7H2O0.3g，（NH4）2SO41g，K2HPO41.36g，膠體幾丁質10g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL。

纖維素培養基：葡萄糖0.5g，KH2PO415g，（NH4）2SO45g，CaCl20.6g，MgSO4·7H2O0.6g，FeSO4·7H2O0.005g，MnSO4·H2O0.0016g，ZnSO4·7H2O0.0014g，CoCl2·6H2O0.0037g，CMCNa10g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL。

蛋白酶培養基：葡萄糖0.5g，明膠10g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL。

1.2菌種分離

沿洞庭湖周邊灘涂濕地采集土樣和水樣，利用選擇性培養基PDAm分離木霉，經單孢分離后保存。

1.3形態學觀察

分別在SNA、PDA和CMD上培養木霉菌株，定期觀察菌落形態及分生孢子梗、瓶梗的發育形態。

1.4分子鑒定

利用OMEGA公司的FungalDNAminiKit試劑盒提取木霉基因組DNA，分別用3對引物ITS1-F/ITS4、EF1-728F/EF200R、fRPB2-5f/fRPB2-7cR進行擴增，PCR產物交上海生工生物股份有限公司進行測序，結果分別提交NCBI和ISTH網站進行比對分析。

1.5生物學功能評價

1.5.1供試植物病原真菌

立枯絲核菌Rhizoctoniasolani、終極腐霉Pythiumultimum、灰葡萄孢Botrytiscinerea、大麗花輪枝孢Verticilliumdahliae、尖孢鐮孢Fusariumoxysporum、瓜果腐霉Pythiumaphanidermatum、致病疫霉Phytophthorainfestans、紋枯絲核菌Rizoctoniacerealis和串珠鐮孢Fusariummoniliforme，均為本實驗室保藏。

1.5.2平板抑菌實驗

平板直徑兩端距中心35mm處分別接種直徑5mm的木霉和病原真菌，以只接種病原真菌為對照，25℃培養，記錄病原真菌對峙方向生長半徑，計算抑制率（%）。

抑制率（%）＝（對照病菌生長半徑－處理病菌生長半徑）/對照病菌生長半徑×100%。

1.5.3平板水解酶活性檢測

主要檢測蛋白酶、纖維素酶和幾丁質酶活性。配制水解酶活性檢測培養基，培養基中加0.05%的曲酮抑制菌落擴散，25℃培養6d，記錄水解圈寬度。

2　結果與分析

2.1菌株采集信息

菌株TW22166采集自湖南省洞庭湖，經度113°0′27.19＂，緯度29°9′19.21＂，采集時間為2015年4月20日，植被類型為雜草，采集人：李紀順、王貽蓮。

2.2菌株形態學特征

菌株TW22166的形態學特征見圖1。于20、25、30、35、40℃培養3d，在SNA培養基上菌落半徑分別為38、64、75、71、15mm；在PDA培養基上菌落半徑分別為43、56、72、66、12mm，最適生長溫度和產孢溫度為30－35℃。于20℃培養7d，在SNA培養基上不產生明顯的分生孢子，菌絲稀疏，成放射狀擴散；在PDA培養基上形成一圈輪紋，氣生菌絲稀疏，并形成孢子簇，孢子簇為顆粒狀分布，灰綠色，培養基背面為淡黃色；在CMD培養基上形成一圈輪紋，白色到灰綠色孢子簇，氣生菌絲稀疏，卷毛狀，培養基背面為淡黃色。

分生孢子梗包括長而發達的主軸，二次分枝豐富，不規則，一般單生，少數二岐式分枝，缺乏不育菌絲。分生孢子梗向頂方向著生單個瓶梗，多數瓶梗直接產生于二次分枝上，成不對稱排列，一般不是漩渦狀排列。瓶梗燒瓶形或圓柱形，在中間稍微膨大，有時彎曲，瓶梗長（4.0－）6.5－10.5（－14.0）μm，最寬處（2.2－）3.0－3.5（－4.5）μm，基部寬（1.0－）2.2－2.6（－3.2）μm。

分生孢子橢圓形，黃綠色，大小為（4.4－）3.9－3.4（－2.4）×（2.8－）2.7－2.5（－2.3）μm。厚垣孢子亞球形，串生、間生或端生，產量較多，大小為（9.4－）7.8－6.4（－5.6）×（8.2－）6.7－5.5（－5.1）μm。

圖1　菌株TW22166的形態特征Fig.1morphological　characteristics　of　strain　TW22166

2.3菌株序列分析

菌株TW22166的ITS序列總長為673bp，在GenBank上的登錄號為KT862523，經www.isth.info中的TrichOKEY進行比對，分別在113、135、314、472、568處發現了木霉的5個DNA寡核苷酸條形編碼，表明TW22166為木霉屬，種類鑒定為Trichodermasp.MA3642。TW22166的tef1序列總長為664bp，在GenBank上的登錄號為KT862524，同TrichodermacapillarestrainGJS99-3［JN175584.1］同源性99%，TW22166的rpb2序列總長為1104bp，在GenBank上的登錄號為KT862525，同TrichodermacapillarestrainGJS06-66［JN175530.1］同源性99%。

選取NCBI中與菌株TW22166的rpb2同源性不小于90%的序列構建系統發育進化樹，結果見圖2，菌株TW22166與TrichodermacapillarestrainGJS06－66［JN175530.1］位于同一分支，而與其他菌株的親緣關系較遠。

圖2　以rpb2基因序列為分子標記的系統發育進化樹Fig.2　Gene　sequences　rpb2　based　phylogenetic　tree

2.4菌株TW22166的平板抑菌作用

菌株TW22166在PDA平板上對供試9種植物病原真菌均具有較好的抑制作用，抑制率范圍為47.0%－100.0%，其中對B.cinerea的抑制率為47.0%，對F.oxysporum的抑制率為100.0%，對其他病原真菌的抑制率介于兩者之間（圖3）。

圖3　菌株TW22166的平板抑菌能力Fig.3　Antifungal　capability　of　strain　TW22166　on　PDA　plate

2.5菌株TW22166的水解酶活性

菌株TW22166在平板上具有蛋白酶活性、幾丁質酶活性及纖維素酶活性，可產生明顯的透明圈，其中蛋白酶活性較高，透明圈寬度為16.0mm，結果見圖4。

A蛋白酶活性B幾丁質酶活性C纖維素酶活性圖4　菌株TW22166的水解酶活性Fig.4　Hydrolase　activity　of　strain　TW22166

3　結論

傳統的木霉生物學鑒定主要依據形態學特征，但木霉的形態性狀復雜多變且易受環境影響，缺少特有形態特征，給分類研究者對其進行種的定義造成了極大的不便。近年來，人們將傳統的形態學分類方法與分子生物學技術相結合應用于木霉屬的分類和系統進化問題的研究中，開創了一個真菌系統分類學的新時代，并取得了顯著的成功［10］。

由于木霉的ITS和tef1序列同源性在種內、種間差異存在重疊，可能導致部分種的錯誤鑒定［11］，本文用rpb2序列構建系統發育進化樹，結果發現菌株TW22166與TrichodermacapillarestrainGJS06-66［JN175530.1］位于同一分支，而與其他菌株的親緣關系較遠，初步斷定菌株TW22166應為Trichodermacapillare。其形態學特征也與其一致［12］，故將菌株TW22166鑒定為Trichodermacapillare。

菌株TW22166分生孢子梗形態屬于長枝組Longibrachiatum，該組木霉的共同特點為菌落生長快，最適生長溫度為30－35℃，在PDA上產生黃色色素，產孢簇為平展或松散的簇狀。分生孢子梗形成于氣生菌絲稀疏的培養物上，典型分生孢子梗包括強壯發達的中軸，初級分枝長，二級分枝通常短且少見再次分枝。瓶梗排列不規則，一般單生，燒瓶形或接近圓柱狀，常為鉤狀或彎曲。分生孢子為橢圓或長方形。厚垣孢子有或者無。

該組種類之間可以根據瓶梗的形態變化相互區別，也可以根據分生孢子的大小和形狀加以區分。T.capillare同其他長枝組木霉種的親緣關系較遠，分枝更加不規則，孢子簇上產生細絲狀的氣生菌絲，顯著或不顯著，有隔膜，彎曲，不育，已知分布為美國、歐洲（奧地利、匈牙利）、越南、中國。

菌株TW22166在平板上產生厚垣孢子的能力較強，利用這一特點，可以重點研究該菌株發酵產厚垣孢子的條件，從而提高發酵產量，制備以厚垣孢子為有效成分的木霉制劑，延長制劑的保存期及抗逆能力。而且菌株TW22166不但對植物病原真菌具有廣譜抗性，還具有多種水解酶活性，是一株較有潛力的生物防治菌株。

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ChinesenewrecordTrichodermacapillareanditsfunctionalassessment

CHENKai，LIJi-shun，ZHANGGuang-zhi，WANGYi-lian，ZHAOXiao-yan，WUXiao-qing，HUJin-dong，YANGHe-tong*

（ShandongProvincialKeyLaboratoryofAppliedmicrobiology，BiologyInstitute，BiotechnologyCenter，ShandongAcademyofSciences，Jinan250014，China）

Abstract：TrichodermastrainTW22166wasisolatedfromsoilsamplesofDongtingLakemudflatwetlandofHunanprovince，China.Itsconidiophoreshadastronglydevelopedcentralaxisfromwhichphialidesarisesinglyoverseverallevelsbelowthetipasinglephialideterminatingabasalcellwithashort，spur-likephialidearisingasanoutgrowthofthebasalcellattheseptum.Throughdetectingmolecularmarkers（ITS，tef1andrpb2），wediscoveredthatitshomologywithTrichodermacapillarewasmorethan99%byNCBI.Inrpb2sequencesbasedphylogenetictree，strainTW22166andTrichodermacapillarestrainGJS06-66［JN175530.1］wereononeidenticalbranch.StrainTW22166exhibitedantifungalcapabilityagainst9plantpathogenicfungionPDAplate，anditsinhibitionratioagainstFusariumoxysporumwasupto100.0%.Ithadproteinase，chitinaseandcellulaseactivity，amongwhichproteinaseactivitywashigheranditshydrolyzationradiuswas16.0mm.StrainTW22166wasidentifiedasTrichodermacapillare，aChinesenewrecordofgenusTrichodermawhichwasapotentialbiologicalpreventionandcontrolstrain.

Keywords：Chinesenewrecord；Trichodermacapillare；antifungalcapability；hydrolaseactivity

中圖分類號：Q939.5；S476

文獻標識碼：A

文章編號：1002-4026（2016）01-0093-05

DOI：10.3976/j.issn.1002－4026.2016.01.016

收稿日期：2015-11-06

基金項目：山東省重點研發計劃（2015GNC113003）；山東省攻關計劃（2014GSF121028）；科技基礎性工作專項（2014FY120900）

作者簡介：陳凱（1968－），女，工程師，研究方向為微生物。Email：chenkai19960917＠163.com

*通訊作者，楊合同（1966－），男，博士，研究員，研究方向為應用微生物。Email：yanght＠sdas.org