利福昔明乳房注入劑的局部刺激性與過敏性試驗研究

王建　程雪嬌　焦曉軍　余貴菊　于小婷　王猛　曾振靈　曾東平

摘 要：為了科學、客觀地評價干乳期利福昔明乳房注入劑在奶牛臨床上應用的安全性，根據相關技術指導原則，分別進行家兔的皮膚刺激性試驗、陰道刺激性試驗及豚鼠主動皮膚過敏性試驗，試驗結果顯示，利福昔明乳房注入劑給藥部位的皮膚和生理鹽水對照組都沒有出現紅斑和水腫，刺激強度的評分為0分；陰道刺激試驗的試驗組和對照組的陰道粘膜沒有出現明顯的白細胞浸潤、充血和水腫現象，陰道粘膜刺激指數為0.25；在皮膚過敏性試驗中，給藥組動物皮膚未見紅斑與水腫，各時間的皮膚刺激反應積分為0。因此，利福昔明乳房注入劑對家兔的皮膚和陰道無刺激性；對豚鼠不產生明顯的皮膚過敏性反應。

關鍵詞：利福昔明乳房注入劑；皮膚刺激；陰道刺激；主動皮膚過敏反應

中圖分類號：S858.23 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.06.006

Study on LocalIrritation and Allergy Tests of Rifaximin Breast Implants

WANG Jian1， CHENG Xuejiao1， JIAO Xiaojun1， YU Guiju1， YU Xiaoting1，WANG Meng1， ZENG Zhengling2，ZENG Dongping2

（1. Tianjin Speerise Challenge Biotechnology Company Limited，Tianjin 300380，China；2. College of Veterinary Medicine， South China Agriculture University， Guangzhou 510640，China）

Abstract： In order to scientifically and objectively evaluate the safety of cows clinical application of rifaximin breast implants in the dry period， referring to the relevant technical specifications， rabbit skin irritation test， vaginal mucous membrane irritation test and guinea pig skin allergy test respectively was studied. The results showed that erythema and edema was not been found on rifaximin breast implants administration site skin and saline control site skin， and score of 0 points. In the vaginal mucous membrane irritation test， leukocyte infiltration， hyperemia and edema was not been found obviously in vaginal mucosa of test group and control group， vaginal mucous membrane irritation index was 0.25. In the skin allergy test， erythema and edema was not been found on test group， skin irritation in each time integral was 0. So， rifaximin breast implants had no irritation on rabbit skin and vaginal mucous membrane； guinea pigs do not produce significant allergic skin reaction after administration.

Key words： rifaximin breast implants； skin irritation； vaginal mucous membrane irritation； skin allergic reaction

利福昔明（rifaximin）是利福霉素的半合成衍生物，和其他利福霉素類抗生素類似，利福昔明通過和細菌DNA-依賴RNA聚合酶的β-亞單位發生不可逆的結合從而抑制細菌RNA的合成，防止了該酶與DNA連接，阻斷RNA轉錄并最終抑制了細菌蛋白質的合成，本品抗菌譜廣，抗菌活性強，對多種革蘭陽性菌（金黃色葡萄球菌、鏈球菌和棒狀桿菌）、革蘭陰性菌（大腸桿菌、巴氏桿菌、假單胞菌和變形桿菌等）均有高度抗菌活性[1-3]。目前，歐盟已批準利福昔明用于干乳期奶牛乳房炎和子宮內膜炎的治療，歐盟規定利福昔明在牛奶中的殘留標示物為原形藥物，最高殘留限量（MRL）為60 μg·kg-1。

利福昔明乳房注入劑（干乳期）是天津市中升挑戰生物科技有限公司研制的新獸藥，用于預防由金黃色葡萄球菌、鏈球菌及大腸桿菌引起的干奶期奶牛乳房炎。為了科學、客觀評價天津市中升挑戰生物科技有限公司研制的干乳期利福昔明乳房注入劑在奶牛臨床上應用的安全性，現根據國家食品藥品監督管理總局關于發布藥物安全藥理學研究技術指導原則等8項技術指導原則的通告（2014年第4號）附件4《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》[4]，及中華人民共和國農業部公告（第1247號）頒布的《獸藥臨床前毒理學評價試驗指導原則》[5]，分別進行了家兔的皮膚刺激性試驗、陰道刺激性試驗以及豚鼠主動皮膚過敏性試驗，對其進行臨床前毒理學評價，預測臨床用藥的安全性，為臨床試驗提供參考。endprint

1 材料和方法

1.1 供試藥品

利福昔明乳房注入劑（干乳期）：規格5.0 mL∶100 mg（以利福昔明計），批號120810，天津市中升挑戰生物科技有限公司。

陽性對照藥：2，4-二硝基氯苯，規格25 g，批號20130726，由天津市光復精細化工研究所提供。

陰性對照藥：0.9%氯化鈉注射液，規格500 mL：4.5 g，批號A10082202，由貴州天地藥業有限責任公司生產。

1.2 試驗動物

新西蘭兔，普通級，體重2 kg左右，雌雄各半，由南方醫科大學實驗動物中心提供[SCXK（粵）2011-0015]。FMMU豚鼠，普通級，雌雄各半，體質量300 g左右，由南方醫科大學實驗動物中心提供[SCXK（粵）2011-0015]。動物購回后環境適應飼養3 d，采用自然光照，試驗期間飼喂全價兔料，飲水充足、不受限制，室溫控制在26 ℃，相對濕度為40%～70%。

1.3 試驗方法

依據相關技術指導原則中的皮膚刺激性試驗、陰道刺激性試驗和主動皮膚過敏性試驗方法[4-6]進行試驗。

1.3.1 皮膚刺激性試驗 將8只新西蘭兔隨機分為完整皮膚組（Ⅰ組）和破損皮膚組（Ⅱ組）兩組，每組4只，雌雄各半。Ⅰ組試驗開始前24 h將動物脊柱兩側對稱部位用電動剃毛器各剃出面積為3 cm×3 cm的無毛區，將試驗動物皮膚脫毛后，檢查去毛區域是否有因去毛而導致的受傷，受傷皮膚不宜再進行刺激性試驗。Ⅱ組破損皮膚是用7號針頭（一次性消毒）按“#”字形劃破已去毛消毒皮膚的表皮層，以出現滲血為標準，左右兩側皮膚的破損程度應基本保持一致。左側為利福昔明乳房注入劑用藥區，取0.5 mL涂布于左側已經去毛的皮膚上，然后用紗布（2.5 cm×2.5 cm）和一層玻璃紙覆蓋，再用無刺激性膠布固定，右側為生理鹽水對照區，貼敷時間為5 h，之后去掉受試物，用溫水清洗用藥部位的皮膚，連續用藥3 d。在每次去除藥物后1 h及再次貼敷前，仔細觀察并記錄紅斑及水腫、涂敷部位是否有色素沉淀、出血點、皮膚粗糙或皮膚菲薄情況及其發生時間及消退時間，并參照皮膚刺激性反應評分標準進行評分（表1），采用同體左右側自身對比。最后一次貼敷后，在去除藥物后30～60 min，24，48，72 h各時間點來觀察并記錄是否有紅斑和水腫等情況出現在涂敷部位。對評分較高或可疑的受試動物處死1只，進行病理組織學檢查，并根據皮膚刺激性強度評價標準和病理學檢查綜合判定結果。多次給藥的皮膚刺激性試驗，先計算每個觀察時間點的各組積分均值，再計算觀察期限內的每天每只動物積分均值，并按照表2進行刺激強度評價。

1.3.2 陰道刺激性試驗 8只雌性新西蘭兔隨機分為攻毒試驗組和正常對照組兩個組，每組4只。往攻毒試驗組的陰道灌注2 mL的利福昔明乳房注入劑，往對照組動物的陰道灌注2 mL的生理鹽水。攻毒后24 h，各組新西蘭兔用空氣栓塞法安樂處死，用手術剪剪開腹盆腔取出完整的陰道，縱向剖開，觀察是否出現充血、水腫等病理現象，將出現充血、水腫等病理現象的陰道放入10%的福爾馬林溶液中固定24 h以上，然后取陰道的兩端和中央三個部位的組織制作病理切片，HE染色后，在顯微鏡下進行組織病理學觀察。然后按粘膜刺激反應評分標準進行評分（表3），最后分值為每組的每一個觀察時間每一動物的粘膜刺激反應分值相加得到的總積分除以這組的動物數。按粘膜刺激強度分級標準進行刺激強度分級（表4）判斷其刺激程度。

1.3.3 主動皮膚過敏性試驗 本試驗采用同體自身對比法，致敏期間左側給予利福昔明乳房注入劑，激發給藥于右側皮膚。取30只豚鼠，雌雄各半，隨機分為陰性對照，陽性藥物對照（2，4-二硝基氯苯）和利福昔明乳房注入劑3組，分別為1組，2組，3組。每組各10只豚鼠。致敏給藥和激發給藥分別于試驗動物的左、右側皮膚進行。致敏給藥：在動物左側脫毛區涂抹0.2 mL受試物，用醫用薄紗布覆蓋并固定住，以防止動物啃咬、損傷用藥部位，保持6 h，并在第7 天和第14 天，重復上述試驗，陰性對照組（生理鹽水）與陽性藥物對照組（0.1%的2，4-二硝基氯苯）的試驗方法同致敏試驗一致。激發給藥：于末次給受試物致敏后14 d，在豚鼠背部右側脫毛區涂抹0.2 mL受試物，6 h后去掉受試物并馬上觀察皮膚的過敏反應情況，并在24，48，72 h再次觀察上述現象，并按表5對紅斑和水腫進行評分，計算過敏反應的發生率，根據表6判斷過敏反應發生程度。

2 結果與分析

2.1 皮膚刺激性試驗

每日觀察新西蘭兔在3 d給藥期及給藥結束后3 d內的給藥部位皮膚情況。試驗結果顯示出，利福昔明乳房注入劑在完整皮膚組和破損皮膚組的給藥部位和對照部位（生理鹽水）均未出現紅斑和水腫現象，根據評分標準評為0分；也沒有發現異常現象如藥源性出血，色素沉淀以及皮膚粗糙。并且試驗動物其他生理現象（飲水、飲食、排泄、外觀、重量）也沒有出現異常。根據國家有關皮膚刺激性試驗皮膚反應評分及反應強度評價標準原則，利福昔明乳房注入劑（干乳期）對新西蘭兔的完整皮膚和破損皮膚，均無刺激性反應，結果見表7。

2.2 陰道刺激性試驗

用藥期間，攻毒試驗組和正常對照組家兔的全身狀況均沒有發現異常，陰道口也沒有出現明顯充血、紅腫及異常分泌物流出。解剖并取出陰道組織進行肉眼觀察，攻毒試驗組的陰道有輕微的粘膜充血、水腫以及出血點現象，陰道粘膜刺激平均分為0.25，依據國家有關陰道粘膜刺激反應評分及反應強度評價標準，利福昔明乳房注入劑對家兔一次性陰道粘膜刺激強度為無刺激性。結果見表8。組織病理學檢查結果見圖1，2。

2.3 主動皮膚過敏性試驗

在試驗過程中，各組試驗動物均未有嚴重的全身性過敏反應發生，如哮喘、站立不穩或休克等過敏現象。利福昔明乳房注入劑組在致敏后0，24，48，72 h致敏反應的平均值皆為0，空白對照組0，24，48，72 h致敏反應的平均分皆為0；陽性對照組2，4-二硝基氯苯致敏和激發期間均出現紅斑和水腫，0，24，48，72 h致敏反應的平均分為5.7，4.6，5.0，5.7，按照國家有關皮膚過敏反應評分及過敏性評價標準，利福昔明乳房注入劑對豚鼠的皮膚為弱致敏性，結果見表9。

3 結 論

本試驗嚴格按照國家食品藥品監督管理總局發布的關于藥物安全藥理學研究技術指導原則等8項技術指導原則的通告（2014年第4號）附件4《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》，及中華人民共和國農業部公告（第1247號）頒布的《獸藥臨床前毒理學評價試驗指導原則》，進行家兔皮膚刺激性試驗、陰道粘膜刺激性試驗和豚鼠的皮膚過敏性試驗，試驗結果顯示利福昔明乳房注入劑對家兔的皮膚和陰道粘膜無刺激性；對豚鼠不產生明顯的皮膚過敏性反應。提示本品的應用安全性良好，臨床使用安全，符合規范要求，值得臨床上進一步推廣應用。

參考文獻：

[1]任淑萍，陳瑞玲.利福昔明的臨床應用[J].臨床藥物治療雜志，2005，3（6）：38-40.

[2]GASZTONYI B H B，Pharmacological Aspects of Rifaximin.Local antibiotic therapy in intestinal disorders[J].Orvosi hetilap，2004，145（43）：2177-2181.

[3]SCRASCIA M，FORCILLO M，MAIMONE F，et al.Susceptibility to rifaximin of Vibrio cholerae strains from different geographical areas[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2003，52（2）：303-305.

[4]藥物刺激性.過敏性和溶血性研究技術指導原則[M].北京：國家食品藥品監督管理局，2014.

[5]農業部獸藥評審中心.獸藥注冊資料匯編[M].北京：農業部獸藥評審中心，2009.

[6]化學品急性皮膚刺激性/腐蝕性試驗方法. 中華人民共和國國家標準[S].北京：中國國家標準化管理委員會，2008.endprint