CIBR處理模擬生活污水的效果及菌群分析

鐘振興，蘭 雄，丁興輝，陸謝娟，章北平

(1．華中科技大學環境科學與工程學院，湖北 武漢，430074;2．武漢市規劃設計有限公司，湖北 武漢，430014;3．中信建筑設計研究總院有限公司，湖北 武漢，430014)

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CIBR處理模擬生活污水的效果及菌群分析

鐘振興，蘭 雄，丁興輝，陸謝娟，章北平

(1．華中科技大學環境科學與工程學院，湖北 武漢，430074;2．武漢市規劃設計有限公司，湖北 武漢，430014;3．中信建筑設計研究總院有限公司，湖北 武漢，430014)

污水處理；CIBR;模擬生活污水；高通量測序；活性污泥；菌群

生活污水是世界各地最主要的污水來源之一，而生物處理工藝是應用最廣、最廉價的污水處理方式，該工藝的核心在于活性污泥中種類繁多的微生物。近年來，采用高通量測序等技術，國內外學者對城市污水處理廠中的活性污泥進行了較為廣泛的研究，對微生物菌群的組成和結構有了較多的認識，但是這些研究的重點主要集中在A2/O、A/O和MBR等常規生物處理工藝上[1-3]。隨著緊湊型一體化生物處理工藝的快速發展和應用，有必要對這類新型工藝中的微生物組成和結構、優勢菌群、功能細菌等進行深入分析。

連續流一體化生物反應器(continuous-flow integrated biological reactor, CIBR)[4]是一種新型高效的一體化生物脫氮除磷工藝設備。本研究在實驗室中采用CIBR處理模擬生活污水，考察CIBR的污水處理效率，為后續處理實際生活污水提供技術參考；同時，采用Illumina高通量測序對CIBR中微生物進行鑒定分析，以便深入了解CIBR中的微生物構成和分布、優勢菌群、功能細菌以及各污染物可能的去除途徑，為CIBR工藝優化管理和性能改善提供明確的指導和建議。

1 材料與方法

1.1 實驗用水

將人工配水和食堂餐飲廢水按1∶1比例混合后的模擬生活污水用作進水，以防止由于微量元素缺乏而導致污泥膨脹、性能不穩等問題。人工配水主要由自來水、葡萄糖、氯化銨、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉及適當微量元素等配制。食堂餐飲廢水取自武漢市華中科技大學東園學生食堂排水井，該廢水和模擬生活污水的水質參數如表1所示。

表1 廢水主要水質特征

1.2 實驗裝置

本實驗采用的連續流一體化生物反應器結構如圖1所示。CIBR采用有機玻璃制作，由進水箱(900 L)和生物系統(470 L)兩部分組成，生物系統包括生物反應區(370 L)、三相分離區(單個10 L，兩側各一個)、沉淀區(單個40 L，兩側各一個)。通過時控開關調節，實現交替曝氣和攪拌，形成好氧、缺氧環境達到脫氮除磷的功效。生物反應區和沉淀區通過三相分離區連通，同時，在三相分離區可以實現泥、水高效分離并自動返回至反應區，以保持系統污泥濃度穩定。

1—進水箱；2—進水管；3—進氣管；4—空氣流量計；5—蠕動泵；6—空氣泵；7—排泥管；8—溢流堰；9—監測儀；10—攪拌槳；11—微孔曝氣管；12—取樣管；13—三相分離區；14—沉淀區；15—生物反應區

圖1 CIBR結構示意圖

Fig.1 Schematic diagram of CIBR

CIBR運行工況為曝氣3 h，攪拌3 h，水力停留時間(HRT)為12 h，每天排泥25 L，控制污泥齡(SRT)約15 d，以確保反應器的除磷效果。接種污泥取自武漢市龍王嘴污水處理廠(簡稱“WWTP”)好氧池，該污水廠采用厭氧-缺氧-好氧(A2/O)工藝，主要處理城市生活污水。

1.3 菌種分析方法

1.3.1 樣本 DNA 抽提和檢測

在CIBR馴化完成并達到穩定后，分別從污水廠好氧池和CIBR中取活性污泥樣品100 mL進行測序分析。樣品微生物 DNA 的提取采用PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒(MOBIO公司，美國)，提取方法按照試劑盒說明書進行。利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA總量和完整性，并用Qubit 3.0熒光定量儀檢測DNA濃度。

1.3.2 細菌16S rDNA序列擴增和MiSeq測序

選取16S rDNA的V4～V5 區序列進行高通量測序分析。采用兩步PCR擴增方法進行文庫構建。將純化的DNA作為模板，利用16S rDNAV4～V5區通用引物515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’)和926R(5’-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3’)PCR擴增目的片段16S rDNA V4～V5區，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測效果較好的樣本于2%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收，以回收產物為模板進行一次8循環的 PCR 擴增，將 Illumina 平臺測序所需要的接頭、測序引物、標簽序列添加到目的片段兩端。全部 PCR 產物采用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司，美國)進行回收，并用 FTC-3000TM Real-Time PCR 儀進行熒光定量，均一化混勻后完成文庫構建，在Illumina MiSeq 2 × 300 bp平臺上完成測序。

第一次PCR反應體系：5×擴增緩沖液 10 μL，dNTP (10 mmol/L) 1 μL, Phusion 超保真 DNA聚合酶1 U，正、反向引物(10 mmol/L)各1 μL，模板DNA 20～50 ng，補充超純水至 50μL。PCR反應條件為94 ℃×2 min；94 ℃×30 s, 56 ℃×30 s，72 ℃×30 s，72 ℃×5 min，25個循環。

第二次PCR反應體系：5×擴增緩沖液8 μL，dNTP (10 mmol/L)1 μL，Phusion超保真DNA聚合酶 0.8 U，正、反向引物(10 mmol/L)各1 μL，模板DNA 5 μL，補充超純水至40 μL。PCR反應條件為 94 ℃×2 min；94 ℃×30 s, 56 ℃×30 s，72 ℃×30 s，72 ℃×5 min，10 ℃保溫，8個循環。

1.3.3 數據分析

對原始數據通過barcode分配樣品reads，得到樣本的有效序列，根據PE reads之間的重疊關系，采用mothur(1.33.2)軟件將成對reads拼接成一條序列，并對序列質量進行篩選和過濾，將模糊堿基、過長和過短的序列以及PCR過程中產生的嵌合體去除，得到優化序列，再進行OTU(operational taxonomic unit)聚類和物種信息注釋。將相似性不低于97%的序列歸為同一分類單元OTU，利用mother (1.33.2)進行一系列群落結構等統計學分析。

1.4 廢水檢測方法

廢水中常規指標檢測方法為：氨氮采用納氏試劑分光光度法(HJ 535—2009)；硝態氮采用麝香草酚分光光度法(GB/T 5750.5—2006)；亞硝態氮采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法(GB/T 7493—87)；COD采用微波消解法；TN采用堿性過硫酸鉀消解-紫外分光光度法(HJ 636—2012)；TP 采用鉬酸銨分光光度法(GB/T 11893—1989)。溫度和溶解氧(DO)采用WTW溶氧儀(WTW-3410)測定，配備有FDO-925型探頭(WTW公司，德國)，pH值采用賽多利斯PB-10型pH計測定(Sartorius公司，德國)。

2 結果與討論

2.1 CIBR對模擬生活污水中污染物的去除效果

(a)COD

-N

(c) TP

Fig.2 Removal efficiency of pollutants in the simulated domestic wastewater by CIBR

2.2 CIBR中微生物菌群多樣性分析

為揭示CIBR中污染物可能的去除途徑，優化運行工況，提高生物系統性能，采用Illumina高通量測序對取自WWTP的接種污泥以及穩定運行期間CIBR污泥中的微生物菌群進行多樣性分析，其結果見表2。

表2 活性污泥中菌群多樣性指數(相似度為97%)

由表2可見，在97%相似水平上，根據Chao和Ace豐富度指數可知WWTP樣品的物種豐富度明顯高于CIBR樣品，而Shannon和Simpson指數也表明CIBR樣品的生物多樣性明顯低于WWTP樣品。上述結果可能主要與兩個生物系統采用不同的處理工藝以及進水水質不同有關。WWTP采用厭氧-缺氧-好氧(A2/O)工藝處理城市生活污水，其運行工況、微生物生長環境和進水水質都相對復雜，而CIBR采用一體化的缺氧/好氧工藝，運行工況、微生物生長環境和進水組分相對簡單[10-12]。已有研究人員[1-2, 13-14]利用方差分解證實，處理工藝和進水水質是影響微生物豐富度和多樣性的最主要因素。另外，兩個樣品的coverage指數均達到99.8%，表明測序結果能很好地反映樣品的真實情況。

2.3 CIBR中菌群結構分析

在門、目和屬3個分類水平上對測序結果進行歸類，分析兩個污泥樣品在不同分類水平上的菌群組成及相對豐度，其結果如圖3～圖5所示。

由圖3可見，在門級別，WWTP樣品生物系統中Proteobacteria和Bacteroidetes的相對豐度分別達到63.6%和23.8%(合計87.4%)，CIBR樣品對應值為71.5%和21.3%(合計92.8%)，二者在污泥菌群中是絕對的優勢物種，這與其他研究人員的報道基本一致。文獻[1-2]中指出，Proteobacteria和Bacteroidetes是大多數城市污水處理廠活性污泥中的優勢菌群，Proteobacteria還是參與降解有機物和芳香族化合物、去除氮磷的最主要菌種。從圖3中還可知，兩個樣品中其余菌群的豐度均低于2%，且分布存在一定相似性。這一方面可能是因為CIBR菌種是從WWTP曝氣池接種而來，另一方面可能是因為CIBR的進水是模擬生活污水，與城市生活污水存在一定的相似性。

圖3 兩個樣品在門級別上的菌群結構對比

Fig.3 Comparison of microbial community structures of two samples at the phylum level

在目級別(見圖4)，Burkholderiales、Sphingobacteriales和Rhodocyclales是WWTP樣品中最主要的菌種，相對豐度均達15.7%～17.2%，Xanthomonadales、Sphingomonadales、Nitrospir-ales和Myxococcales的相對豐度為4.4%～5.3%，這七種菌群是WWTP接種污泥中的優勢菌種，且分布相對較為均勻。Rhodocyclales (相對豐度為41.8%)是CIBR樣品中最主要的優勢菌種，相比接種污泥其豐度明顯增加，這可能是因為該菌種能很好地適應CIBR好氧/缺氧交替運行的特點。CIBR樣品中Burkholderiales和Sphingobacteriales的相對豐度基本不變，分別為15.7%和17.2%，表明二者對CIBR反應器有較好的適應能力。

圖4 兩個樣品在目級別上的菌群結構對比

Fig.4 Comparison of microbial community structures of two samples at the order level

在屬水平(見圖5)，Ferribacterium和Prevotella均為WWTP和CIBR樣品中的優勢厭氧菌，Ferruginibacter、Haliangium和Novosphin-gobium是WWTP樣品中的優勢好氧菌。上述

(a) WWTP樣品

(b) CIBR樣品

厭氧菌和好氧菌是WWTP厭氧池和好氧池中降解有機物的主要貢獻者[15]。CIBR樣品中好氧菌豐度為11.2%，低于WWTP污泥好氧菌豐度19.4%。Haliangium(相對豐度1.7%)和Ferruginibacter(相對豐度3.0%)是CIBR樣品中的優勢好氧菌，在CIBR曝氣階段，兩者均能分解利用有機物。兩個生物系統中兼性菌的豐度分別為4.3%和20.3%，主要差異來自Zoogloea。Zoogloea是典型的兼性菌，在好氧條件下分解有機物，在缺氧或厭氧條件下利用有機物，同時參與反硝化作用除硝氮[16]。CIBR樣品中Zoogloea豐度明顯增加，可能是因為該菌屬能較好適應CIBR中好氧/缺氧交替運行的環境。

兩種污泥中氨氧化菌(AOB)(Nitrosomonas)和亞硝氮氧化菌(NOB)(CandidatusNitrotoga和Nitrospira)種類完全一致，但相對豐度差異較大，WWTP樣品中AOB和NOB相對豐度分別為2.7%和2.4%，而CIBR樣品對應值僅為0.5%和0.7%。這可能與WWTP采用A2/O工藝有關，該工藝中厭氧池、缺氧池和好氧池相對獨立，各自控制不同的溶氧，有利于專屬菌種的適應和生長。盡管CIBR樣品中AOB和NOB相對豐度較低，但并不影響該反應器高效的硝化作用。Ma等[17]發現，在活性污泥中AOB和NOB豐度僅為0.01%～1%的條件下，所調查的9個焦化廢水生物處理廠均能實現廢水中氨氮的高效去除，類似結果也被其他研究所證實[18]。

CIBR樣品中反硝化菌相對豐度為12.2%，略低于WWTP樣品對應值(14.1%)。Dechloromonas和Thermomonas是兩個生物系統中最主要的反硝化菌，相對豐度分別達6.8%～9.1%和1.0%～3.0%。CIBR樣品中其他反硝化菌的種類明顯少于WWTP樣品，可能是因為WWTP進水有機物種類相對復雜并且有獨立的缺氧池，有利于異養反硝化菌的多樣性生長和代謝[19]。此外，CIBR能達到較好的TP去除效果，可能與聚磷菌(PAOs)有關。Gemmatimonas是WWTP樣品中主要的聚磷菌(相對豐度0.7%)，而CIBR樣品中的主要聚磷菌為CandidatusAccumulibacter(相對豐度0.7%)，不同種類的聚磷菌可能與兩個系統的工況差異和進水磷形態差異有關，這有待于進一步的研究證實。

3 結論

(2)高通量測序發現，在門級別，Proteobacteria和Bacteroidetes是WWTP接種污泥和馴化完后CIBR活性污泥中最主要的菌群。在屬水平上，兩個生物系統中好氧菌、兼性菌、反硝化菌、AOB、NOB以及聚磷菌(PAOs)的種類和豐度均存在明顯差異，這可能與運行工況和進水水質不同有關。

(3) 通過分析兩個生物系統的菌群差異，不僅可以揭示CIBR高效去除有機物和氮磷的途徑，還可在一定程度上解釋兩個系統中含碳氮磷等污染物的去除率和去除途徑差異。

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[責任編輯 尚 晶]

Performance and bacterial community analysis of continuous-inflow integrated biological reactor treating simulated domestic wastewater

ZhongZhenxing1,LanXiong2,DingXinghui3,LuXiejuan1,ZhangBeiping1

(1.School of Environmental Science and Engineering, Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430074, China; 2. Wuhan Planning and Design Company, Wuhan 430014, China;3. CITIC General Institute of Architectural Design and Research Co., Ltd., Wuhan 430014, China)

wastewater treatment; CIBR; simulated domestic wastewater; high-throughput sequencing; activated sludge; bacterial community

2016-09-06

國家高技術研究發展計劃(863計劃)資助項目(2012AA06A304); 國家科技支撐計劃資助項目(2012BAC05B02).

鐘振興(1985-)，男，華中科技大學博士生. E-mail: xing2006z@163.com

章北平(1956-)，男，華中科技大學教授，博士生導師. E-mail: probpzhang@126.com

X703.1

A

1674-3644(2016)06-0439-07