大鼠肝微粒體中睪酮及其代謝產(chǎn)物 6β -羥基睪酮的高效液相色譜檢測方法的改進

趙燕燕，柳亞飛，劉麗艷，孫東，王靜

(1.河北大學化學與環(huán)境科學學院，河北保定　071002；2.河北大學藥學院，河北保定　071002;3.河北大學醫(yī)學實驗中心，河北保定　 071000)

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大鼠肝微粒體中睪酮及其代謝產(chǎn)物 6β -羥基睪酮的高效液相色譜檢測方法的改進

趙燕燕1,2，柳亞飛1，劉麗艷3，孫東1，王靜1

(1.河北大學化學與環(huán)境科學學院，河北保定071002；2.河北大學藥學院，河北保定071002;3.河北大學醫(yī)學實驗中心，河北保定 071000)

摘要：建立快速、準確、靈敏的高效液相色譜法，對大鼠肝微粒體中的探針藥物睪酮及其代謝產(chǎn)物6β-羥基睪酮進行準確定量分析，用于體外評價大鼠肝微粒體CYP3A酶的活性.對色譜條件進行優(yōu)化，采用Durashell C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以10 mmol/L Na2HPO4水溶液(pH 9.26)-乙腈-甲醇(58∶32∶10，體積比)為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長245 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL.大鼠肝微粒體與睪酮標準品在37 ℃進行溫孵，用固相萃取小柱對溫孵產(chǎn)物進行萃取，用甲醇-水(體積比1∶1)復溶上機分析.6β-羥基睪酮和睪酮分別在0.05～10 mg/L和0.2～20 mg/L內(nèi)線性關(guān)系良好(r>0.999 5)，檢出限分別為0.003 4和0.034 mg/L(S/N≥3)，定量限分別為0.011和0.114 mg/L(S/N≥10)，加標回收率分別為100.1%和99.2%，相對標準偏差(RSD)分別為1.75%和1.13%.該方法符合生物樣品測定標準.適合體外測定6β-羥基睪酮和睪酮含量，進而用于評價藥物對肝微粒體CYP3A酶活性的影響.

關(guān)鍵詞：大鼠肝微粒體；睪酮；6β-羥基睪酮；高效液相色譜法

細胞色素P450[1]混合功能氧化酶系統(tǒng)(CYP450)是最大的藥物代謝酶蛋白超家族，它的CYP3A亞族是最重要的功能成分，不僅含量占CYP450總量的30%[2]左右，該酶還在許多內(nèi)源性和外源性化合物的代謝中起著重要作用[3].CYP3A酶的活性可被一些藥物抑制或誘導，其活性的改變，關(guān)系著藥物在體內(nèi)的代謝快慢、作用強度和毒性大小，因此準確評價藥物代謝過程中對CYP3A酶活性影響具有十分重要的意義.

目前，國內(nèi)外相關(guān)文獻[4-6]大多選用睪酮作為CYP3A的探針底物，通過測定其在肝微粒體中的代謝產(chǎn)物6β-羥基睪酮(6β-hydroxytestosterone，6β-OHT)的含量變化，對該酶的活性進行評價.但睪酮在肝微粒體中的代謝產(chǎn)物較為復雜，目前文獻報道的高效液相色譜檢測方法多為梯度洗脫，檢測物質(zhì)多，分離度好，但操作和樣品預處理方法過于繁瑣[6-9]；等度洗脫方法難以實現(xiàn)對大鼠肝微粒體溫孵體系中睪酮及其眾多代謝產(chǎn)物的有效分離，色譜峰峰形較差[10]，無法對其進行準確定量，目標代謝產(chǎn)物6β-羥基睪酮保留時間較長，且存在檢出限高、線性范圍窄及靈敏度低[7，11]等問題；采用液-質(zhì)聯(lián)用[12]或超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用[13]對儀器設(shè)備要求較高.建立一種快速、穩(wěn)定、靈敏度高，適合睪酮及其代謝產(chǎn)物6β-羥基睪酮的分離檢測方法，并將其應(yīng)用于體外CYP3A酶活性的評價及酶動力學的研究具有重要的現(xiàn)實意義.

1實驗部分

1.1儀器與試劑

LC-20ATVP高效液相色譜儀(日本島津公司)、SPD-20Avp紫外-可見檢測器、LabSolutions工作站；ELx800全自動酶標儀(美國BIO-TEK公司)；PT2100臺式均漿機(瑞士Times New Roman公司)；DELTA-320型酸度計(梅特勒-托利多儀器有限公司)；TGL-16G離心機(上海安亭科學儀器廠)；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；AUW120D十萬分之一電子分析天平(日本島津公司)；LSPE-12固相萃取裝置(山東聯(lián)眾分析儀器有限公司)；Cleanert ODS C18固相萃取小柱(北京卓信偉業(yè)科技有限公司)；SK-1快速混均器(常州國華電器有限公司)；DSHZ-300多用途水浴恒溫振蕩器(江蘇太倉市實驗設(shè)備廠).

睪酮(德國Dr.Ehrenstorfer公司，批號：10519)，制成質(zhì)量濃度為200 μg/mL的標準儲備液備用；6β-羥基睪酮(美國Cerilliant公司，批號：FN04141413)，質(zhì)量濃度為100 μg/mL.還原型輔酶Ⅱ、二硫基赤蘚醇、BCA蛋白檢測試劑盒(均購自北京索萊寶科技有限公司).甲醇、乙腈為色譜級.磷酸氫二鈉為分析純.水為二次去離子水.

1.2實驗動物

Wistar大鼠，體重(200±20)g，購自河北省實驗動物中心，合格證號為SCXK(冀)2013-1-003.

1.3改進方法的色譜條件

Durashell C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為10 mmol/L Na2HPO4水溶液(pH 9.26)-乙腈-甲醇(58∶32∶10，體積比)；流速為1 mL/min；檢測波長為245 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL.

1.4肝微粒體制備、溫孵實驗及樣品處理方法

實驗動物禁食24 h，自由給水，脫頸處死后迅速取出肝臟，用鈣沉淀法制備肝微粒體.BCA蛋白試劑盒測定大鼠肝微粒體蛋白濃度.

精密量取50 μL睪酮標準品溶液，緩和通N2吹干，加入甲醇-水(1∶1,體積比)50 μL復溶，加入適量肝微粒體使其終濃度為1 mg/mL，以磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)補足體積，溫孵體系終體積為500 μL.進行溫孵反應(yīng)，固相小柱萃取法[7]處理樣品，0.45 μm濾膜過濾，上機分析.

1.5酶動力學方程

在溫孵體系中加入質(zhì)量濃度為8～200 μg/mL的睪酮標準品，1 mg/mL肝微粒體，溫孵時間30 min，按1.4節(jié)進行溫孵實驗和樣品處理方法進行處理，按照1.3節(jié)色譜條件上機分析，測定溫孵體系中睪酮剩余量，計算底物睪酮與肝微粒體酶反應(yīng)的初速度，進行CYP3A酶代謝睪酮的酶動力學參數(shù)測定[14].

根據(jù)米氏方程：V=Vmax[S]/(Km+[S])，對其兩邊分別取倒數(shù)得Lineweaver-Burk方程：1/V=(Km/Vmax) ×1/[S]+1/Vmax.以1/V(Y，min/mg/μg)對1/[S](X，mL/μg)作圖，進行線性回歸.線性方程為Y=60.995X+0.322(R2=0.993)，方程截距的倒數(shù)即為酶催化反應(yīng)的最大反應(yīng)速率Vmax=3.106 μg/(min·mg)，方程斜率乘以Vmax即為米氏常數(shù)Km(酶促反應(yīng)速率達最大值一半時的底物濃度)=189.450 μg/mL，Vmax/Km為內(nèi)在代謝清除率Clint=0.016 mL/(min·mg).

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件的改進

2.1.1流動相體系的選擇

實驗在參考相關(guān)文獻[6,7]的基礎(chǔ)上，考察了乙腈-磷酸溶液體系、乙腈-磷酸鹽(NaH2PO4、Na2HPO4)溶液體系、乙腈-NaH2PO4-三乙胺溶液體系、甲醇-乙腈-磷酸鹽(NaH2PO4、Na2HPO4)溶液體系為流動相時分別對6β-羥基睪酮和睪酮的分離度、保留時間及色譜峰形的影響.結(jié)果表明，以乙腈-(體積分數(shù)為0.05%磷酸)溶液體系為流動相，分析時間過長(tR>30 min)，且睪酮峰形嚴重拖尾；以乙腈-(10 mmol/L NaH2PO4)-(5 mmol/L三乙胺)溶液體系為流動相，各化合物保留時間顯著縮短，睪酮峰形拖尾未改善，且需以磷酸溶液調(diào)節(jié)pH，操作繁瑣；以乙腈-磷酸鹽(NaH2PO4、Na2HPO4)溶液體系為流動相，6β-羥基睪酮與雜質(zhì)峰難以達到分離；以甲醇-乙腈-(10 mmol/L Na2HPO4)溶液體系為流動相，睪酮色譜峰峰形尖銳對稱，6β-羥基睪酮分離效果好(見圖1)，故本實驗選擇其作為流動相體系.

1.6β-羥基睪酮；2.睪酮.圖1　甲醇-乙腈-10 mmol/LNa2HPO4(pH 9.26，10∶32∶58，體積比)溶液體系為流動相色譜Fig.1　HPLC chromatograms of methanol-acetonitrile 10 mmol/L Na2HPO4 aqueous solution(pH 9.26，10∶32∶58，volume fraction)

2.1.2有機相加入比例的選擇

實驗考察了在甲醇-乙腈-10 mmol/L Na2HPO4溶液體系中甲醇-乙腈加入比例(0∶35、10∶31、10∶32、10∶33、10∶34，均為體積比)對6β-羥基睪酮和睪酮的分離度、保留時間及色譜峰形的影響.結(jié)果表明，在甲醇-乙腈加入比例為0∶35(體積分數(shù))時，流動相洗脫能力強，各組分出峰時間短，但無法完全分離；隨著甲醇加入比例的增加、乙腈加入比例的減少，各色譜峰保留時間逐漸延長，分離度增大；隨著乙腈比例的調(diào)整，分離度不同，當甲醇-乙腈加入比例為10∶32(體積比)時，各化合物保留時間合適，6β-羥基睪酮與雜質(zhì)峰達到基線分離，睪酮色譜峰峰形對稱；繼續(xù)增大乙腈加入比例，分離度降低.故實驗選擇甲醇-乙腈加入比例為10∶32(體積比)，再通過考察磷酸鹽的種類和濃度進一步改善分離和峰形.

2.1.3 緩沖鹽種類和濃度的選擇

流動相中加入緩沖鹽可增強其離子強度，減弱化合物中極性基團與色譜柱上殘余硅羥基的結(jié)合，改善峰形.實驗考察了NaH2PO4濃度在5～50 mmol/L、Na2HPO4濃度在5～20 mmol/L內(nèi)對各色譜峰分離度、靈敏度、保留時間及色譜峰形的影響.結(jié)果表明，在上述不同種類及濃度磷酸鹽條件下，6β-羥基睪酮的保留時間變化不大(波動<0.2 min)；6β-羥基睪酮的色譜峰分離度在10 mmol/L Na2HPO4鹽溶液條件下達到最大值為1.641，同時睪酮色譜峰峰形最佳.不同種類及濃度的磷酸鹽對色譜峰分離度及拖尾因子影響見表1.實驗表明，在改善睪酮色譜峰的拖尾情況中，Na2HPO4磷酸鹽優(yōu)于NaH2PO4.綜上，實驗最終選擇的磷酸鹽溶液為10 mmol/L Na2HPO4.

表1　不同種類及濃度的磷酸鹽對色譜峰分離度及拖尾因子影響

2.1.4pH值的選擇

實驗考察了流動相pH值(2.22～9.46)對各色譜峰的保留時間、分離度以及色譜峰形的影響.結(jié)果表明，隨著pH值升高，對6β-羥基睪酮、睪酮色譜峰保留時間、分離度等影響不明顯.當pH為9.26時，睪酮色譜峰拖尾因子T值為0.976，最接近1，滿足色譜分析的要求.綜上，實驗選擇pH值為9.26.

2.1.5柱溫的選擇

升高溫度，可以加快分析速度、提高分離效率，在一定溫度范圍內(nèi)還可增大柱效及改善色譜峰形[15].本實驗考察了不同柱溫(25、30、35、40、45 ℃)對各色譜峰保留時間、分離度、色譜峰形及理論塔板數(shù)的影響(見圖2).結(jié)果表明，隨著柱溫的升高，色譜峰的保留時間明顯縮短，但對分離度的影響不明顯；柱溫為30 ℃時，理論塔板數(shù)和拖尾因子(T=0.968，符合化學分析的要求)均達到最大值，柱溫大于30 ℃時，理論塔板數(shù)明顯減少.實驗選擇柱溫為30 ℃.

圖2　柱溫對(a)保留時間、(b)分離度、(c)拖尾因子及(d)理論塔板數(shù)(N)的影響Fig.2　Effect of the column temperature on(a) retention time、(b)resolution、(c)tailing factor and(d) N

2.2方法專屬性實驗

分別量取6β-羥基睪酮和睪酮的混合標準品、空白(正常、滅活)肝微粒體、肝微粒體(正常、滅活)溫孵睪酮和正常肝微粒體溫孵睪酮樣品中加入6β-羥基睪酮和睪酮的混合標準品溶液，按照1.3節(jié)色譜條件進樣分析，色譜圖見圖3.結(jié)果表明，溫孵反應(yīng)得到的其他代謝產(chǎn)物在該色譜條件下均能與6β-羥基睪酮和睪酮色譜峰良好分離，說明所建立的HPLC法具有良好的專屬性.

2.3方法學考察

2.3.1線性關(guān)系和檢出限

精密量取6β-羥基睪酮和睪酮標準品儲備液，用標準品溶劑逐級稀釋，得到一系列質(zhì)量濃度不同的溶液，各取50 μL置于10 mL離心管中，按1.4節(jié)溫孵實驗及樣品處理方法進行處理，按照1.3節(jié)色譜條件進樣分析，記錄色譜圖.分別以6β-羥基睪酮和睪酮的峰面積Y對質(zhì)量濃度X(mg/L)作圖，繪制標準曲線；按3倍信噪比(S/N≥3)確定檢出限，10倍信噪比(S/N≥10)確定定量限.6β-羥基睪酮和睪酮的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限(LOD)及定量限(QOD)見表2.

表2　6β-羥基睪酮和睪酮的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限(LOD)及定量限(QOD)

Y：峰面積；X：質(zhì)量濃度，mg/L；r2：相關(guān)系數(shù).

2.3.2加標回收率

精密量取滅活肝微粒體溫孵樣品溶液，分別加入質(zhì)量濃度為0.40，0.50，0.60 mg/L的6β-羥基睪酮和質(zhì)量濃度為0.65，0.80，0.95 mg/L的睪酮標準品溶液.按1.4節(jié)溫孵實驗及樣品處理方法進行處理，按照1.3節(jié)色譜條件進樣分析，記錄色譜圖.取峰面積值計算加標回收率及RSD，6β-羥基睪酮和睪酮的加標回收率見表3.

1.6β-OHT；2.睪酮.a.混合標準品；b.正常肝微粒體；c.滅活肝微粒體；d.滅活肝微粒體溫孵睪桐；e.正常肝微粒體溫孵睪酮；f.正常肝微粒體溫孵睪酮加標.圖3　專屬性液相色譜Fig.3　HPLC chromatograms of method specificity

物質(zhì)質(zhì)量濃度/(mg·L-1)加入量/(mg·L-1)低 中 高檢出量/(mg·L-1)低 中 高加標回收率/%RSD/%6β-OHT00.40.50.60.410.490.61100.131.75睪酮00.650.80.950.640.800.9599.21.13

2.3.3精密度

精密量取正常肝微粒體溫孵樣品溶液，分別加入質(zhì)量濃度為0.5，5.0，10.0 mg/L的6β-羥基睪酮和質(zhì)量濃度為0.5，5.0，20.0 mg/L的睪酮標準品溶液.按1.4節(jié)進行溫孵實驗和樣品處理方法進行處理，1.3節(jié)色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，計算日內(nèi)精密度RSD.取上述溶液，上述方法連續(xù)測定3天，計算其日間精密度RSD，結(jié)果見表4.

表 4　6β-羥基睪酮和睪酮的日內(nèi)和日間精密度(n=5)

2.3.4穩(wěn)定性

精密量取滅活肝微粒體溫孵樣品溶液，分別加入質(zhì)量濃度為0.5，5.0，10.0 mg/L的6β-羥基睪酮和質(zhì)量濃度為0.5，5.0，20.0 mg/L的睪酮標準品溶液，分別在室溫放置0、4、8、12、24 h及置于-70 ℃冰箱1、3、7、15、30 d解凍，按1.4節(jié)溫孵實驗和樣品進行處理，按照1.3節(jié)色譜條件進樣分析，其RSD值分別為0.7%～7.0%和2.3%～10%，符合生物樣本分析要求.但如果在室溫放置12 h或-70 ℃放置15 d內(nèi)完成實驗，其RSD值分別為0.7%～3.0%和2.3%～7%，結(jié)果會更好.

3討論

本研究在優(yōu)化改進文獻方法的基礎(chǔ)上，建立了快速、靈敏、準確測定肝微粒體溫孵體系中6β-羥基睪酮及睪酮含量的高效液相-紫外檢測方法，該方法適合體外實驗中6β-羥基睪酮及睪酮的定量，為評價藥物對CYP3A酶作用的影響及酶動力學研究提供簡便、可靠的分析方法.流動相采用10 mmol/L Na2HPO4水溶液(pH 9.26)-乙腈-甲醇(58∶32∶10，體積比)，與文獻[6-7]報道方法比較，本研究建立的色譜條件，運用等度洗脫使6β-羥基睪酮在6.34 min時檢出，并且與雜質(zhì)峰分離度高(R大于1.6)、睪酮色譜峰形尖銳對稱.

藥物代謝的主要器官是肝臟，藥物在肝臟中進行生物轉(zhuǎn)化則依賴于肝微粒體中的多種酶系，其中細胞色素P450酶在藥物代謝中占有重要地位，CYP3A亞家族為CYP酶總含量的30%左右，據(jù)統(tǒng)計臨床上有60%左右的藥物經(jīng)CYP3A催化代謝，該酶通過氧化許多內(nèi)源性和外源性化合物參與生物體的代謝過程，如催化內(nèi)源性物質(zhì)睪酮的6β羥基轉(zhuǎn)化.藥物可通過抑制或誘導改變CYP3A酶的活性，而這嚴重影響藥物在生物體內(nèi)的代謝快慢、作用強度和毒性大小，如CYP3A活性被抑制時，使藥物代謝減慢，作用雖有所增強，但不良反應(yīng)和毒性相應(yīng)增加，嚴重時可危及生命，因此臨床必須準確評價藥物在代謝過程中對CYP3A酶活性影響.評價酶的活性可運用探針藥物的代謝率[16]推斷藥物對CYP3A酶活性產(chǎn)生誘導或抑制作用，或運用藥物對酶的相對百分活性(%)[17]計算半數(shù)抑制濃度(IC50)進而判斷藥物對酶的抑制程度等級.本課題組將運用上述方法進一步研究中藥甘草中主要有效成分18α-甘草酸和18β-甘草酸[18]對大鼠肝微粒體CYP3A酶活性的影響.

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(責任編輯：梁俊紅)

Improvement on HPLC detection method of testosterone and it’s metabolite 6β -hydroxytestosterone in rat liver microsomes

ZHAO Yanyan1,2,LIU Yafei1,LIU Liyan3,SUN Dong1,WANG Jing1

(1.College of Chemistry and Environmental Science,Hebei University,Baoding 071002,China；2.College of Pharmaceutical Sciences,Hebei University,Baoding 071002,China;3.Experimental Center of Medicine,Hebei University,Baoding 071000，China)

Abstract:A rapid,accurate and sensitive high performance liquid chromatography method was improved for accurate quantitative analysis of probe drugs testosterone and its metabolites 6β-hydroxytestosterone in rat liver microsomes,which was used in vitro to evaluate the activity of CYP3A enzyme in rat liver microsomes.Chromatography conditions were optimized,the experiment was carried out on a Durashell C18 column(250 mm×4.6 mm,5 μm),with 10 mmol/ L Na2H-PO4 solution(pH 9.26)-acetonitrile-methanol(58∶32∶10,V/V/V) as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min,and the detection wavelengthwas set at 245 nm.The column temperature was 30 ℃ and the injection volume was 10 μL.Rat liver micro-somes and testosterone standards were incubated at 37 ℃,incubation products were extracted by solid phase extraction column,then reconstituted with methanol-water(1∶1,V/V) for HPLC analysis.6β - hydroxytestosterone and testosterone showed good linearities within 0.05～10 mg/L and 0.2～20 mg/L(r>0.999 5),respectively.The detection limits for 6β -hydroxytestosterone and testosterone were 0.0034 and 0.034 mg/L(S/N≥3)and the quantitative limits for 6β -hydroxytestosterone and testosterone were 0.011 and 0.114 mg/L(S/N≥10).The recoveries were 100.1% and 99.2% and the relative standard deviation(RSD) were 1.75% and 1.13% respectively.This method met the requirements of biological sample which was suitable for the quantitation of 6β -hydroxytestosterone and testosterone in vitro assays.Furthermore,with this method we could evaluate the impact of drug on the activity of CYP3A enzyme in liver microsomes and carry out the enzyme metabolism kinetics research

Key words:rat liver microsomes;testosterone;6β -hydroxytestosterone;HPLC

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2016.01.008

收稿日期：2015-06-25

基金項目：河北省自然科學基金項目(h1013201203)；河北大學醫(yī)學學科專項資金建設(shè)資助項目(2014A1003)

中圖分類號：O657.7

文獻標志碼：A

文章編號：1000-1565(2016)01-0043-09

第一作者：趙燕燕(1960—)，女，天津市人，河北大學教授，主要從事藥學以及將現(xiàn)代分離技術(shù)用于臨床、藥學、食品、環(huán)境等方面的研究工作.E-mail：zhaoyany606@tom.com