GALNT14與MT2A相互作用驗證

左濤,劉學敏,單金帥,湯靜珍,吳琛

(河北大學生命科學學院,河北保定　071002)

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GALNT14與MT2A相互作用驗證

左濤,劉學敏,單金帥,湯靜珍,吳琛

(河北大學生命科學學院,河北保定071002)

摘要：利用免疫共沉淀(Co-IP)和蛋白沉降實驗(GST pull-down),分別從體內外對N-乙酰氨基半乳糖轉移酶(GALNT14)與金屬硫蛋白2A(MT2A)之間的相互作用進行了驗證.將MT2A全長cDNA片段克隆到pET-DsbA和pCMV-Myc載體上.表達并純化了His-Dsba-MT2A和GST-GALNT14蛋白,在體外通過GST pull-down技術分析,顯示MT2A能與GALNT14結合,證實了二者在體外的直接相互作用.繼而,共轉染pCMV-Myc-MT2A和pCDNA3.1-Flag-GALNT14到人乳腺癌細胞株MCF-7中,通過免疫共沉淀實驗發現抗Myc抗體可以將GALNT14從細胞裂解液中沉淀下來,證實了它們在胞內的相互作用.結果顯示了GALNT14和MT2A在體內外條件下能夠發生直接相互作用,這為進一步明確GALNT14的功能及作用機制奠定了基礎.

關鍵詞：N-乙酰氨基半乳糖轉移酶14(GALNT14)；金屬硫蛋白2A(MT2A)；蛋白沉降實驗(GST pull-down)；免疫共沉淀(Co-IP)

腫瘤的發展常伴隨細胞表面糖蛋白的改變[1].在腫瘤細胞中經?？梢杂^察到一些不成熟的糖蛋白糖鏈變異表達[2],而O-糖基化改變是腫瘤細胞的共性.N-乙酰氨基半乳糖轉移酶(N-acetylgalactosaminyltransferases,GALNTs)家族是黏蛋白O-糖基化的起始酶,屬于Ⅱ型跨膜蛋白[3],負責將供體UDP-GALNAc上GALNAc基團轉移至受體蛋白質多肽鏈特定序列中的Ser或Thr羥基上,從而合成O-聚糖[4-5].

基因數據庫比較分析結果提示該酶家族可能有24個潛在的成員組成[5].Ten Hagen等[5]提議按照酶功能鑒定的先后順序來重新排定GALNT的次序[6-7].該酶家族的一些成員可作為腫瘤診斷及檢測的有效標志物.如GALNT3可作為結腸癌可靠的診斷指標[8],GALNT3基因突變可以作為持續骨皮質增生癥分子生物學研究中的一個非常有用的鑒別診斷工具[9-10].Berois等[11]發現GALNT6是乳腺癌診斷的一個新的免疫組化標志物.Freire等[12]發現GALNT1、T2、T3、T6 及T7均在乳腺癌細胞中表達,其中GALNT6顯示出最好的特異性.隨后的實驗發現GALNT6可作為一個特異性標志物用于乳腺癌細胞擴散的分子診斷,GALNT6可修飾MUC1的糖基化并調控乳腺癌細胞的增殖[13].GALNT13可作為分子標記診斷骨髓神經母細胞瘤[14].吳士良等[15]的研究顯示GALNT2低表達可能與腫瘤浸潤轉移具有相關性.臺灣的Wu等[16]人最新研究顯示GALNT2可改變與EGF受體連接的O-聚糖從而影響EGF與EGFR結合后介導的信號應答,而且GALNT2還能抑制EGFR及其下游信號分子的磷酸化,參與肝細胞癌的惡性轉化.

Wang等[17]從人類胃癌細胞系的cDNA擴增產物首先發現并命名了GALNT14,GALNT14隸屬于乙酰氨基半乳糖苷轉移酶家族.Wu等[18]首次發現GALNT14為一個新的IGFBP-3相互作用蛋白.隨后的研究發現GALNT14在IGFBP-3誘導的細胞凋亡過程中發揮重要作用[19],GALNT14可能參與乳腺癌的惡性進展并與侵襲轉移有關[20].GALNT14可調控腫瘤細胞的侵襲及轉移能力[21],但它作用的機制尚不清楚.蛋白質是生命活動的體現者和執行者,蛋白質之間的相互作用幾乎參與了每一個生物學過程,并在其中扮演極其重要的角色.為了闡明GALNT14影響腫瘤轉移機制,發現新的GALNT14相互作用蛋白可能為之提供有益的幫助.

本實驗室在前期大規模酵母雙雜交文庫篩選獲得了候選相互作用蛋白MT2A的基礎上,通過Co-IP及GST pull-down方法進一步驗證GALNT14與MT2A之間的相互作用,為進一步研究GALNT14的功能及MT2A-GALNT14蛋白質復合體在GALNT14促進腫瘤侵襲轉移中的作用機制奠定基礎.

1材料與方法

1.1材料

人乳腺癌細胞株MCF-7、大腸桿菌Dpα和BL21、pCMV-Myc、pET-DsbA、pGEX-4T-1-GALNT14原核重組表達載體、pcDNA 3.1-Flag-GALNT14 真核重組表達載體均為本實驗室保存.DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA Marker( 2 000 ku)、dNTP、Oligo(dT)、各種分子克隆工具酶均購自大連寶生物工程有限公司.無內毒素質粒提取試劑盒購自美國Omega生物技術公司.BCA蛋白定量試劑盒、質粒小提試劑盒購自北京博邁德生物技術有限公司.DMEM細胞培養基、陽離子脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000、增敏化學發光底物試劑(ECL)購自Life Technologies Corporation.Glutathione-Sepharose 4B購自美國GE Healthcare公司.鎳柱、顯影液、定影液購自北京康為世紀生物科技有限公司.抗Flag標簽鼠源單克隆抗體抗購自美國Sigam-Aldrich生物公司,抗His鼠單克隆抗體、抗Myc標簽鼠單克隆抗體、抗GAPDH鼠單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司,抗Myc兔單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology有限公司.胎牛血清及蛋白分子質量標準購自北京全式金生物技術有限公司.顯影膠片購自柯達公司.所用PCR引物合成及測序工作由深圳華大基因公司完成.

1.2方法

1.2.1細胞培養

MCF-7細胞在含體積分數為10%的胎牛血清的DMEM培養基中,于37 ℃、體積分數為5%的CO2飽和濕度培養的孵化箱中培養,用質量分數為0.25%的胰酶常規消化傳代.

1.2.2MT2A表達載體構建

根據表達載體pCMV-Myc的多克隆位點和MT2A全長編碼序列設計引物,上、下游引物分別引入SalI和NotI酶切位點.以293T cDNA文庫為模板釣取MT2A全長cDNA序列.PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離后切膠回收,將回收的MT2A cDNA定向克隆入真核表達載體pCMV-Myc,轉化大腸桿菌感受態細胞后挑取單克隆進行擴大培養.最后提取質粒進行雙酶切鑒定,酶切鑒定正確的克隆送公司測序,測序結果與GenBank中公布的序列對比.重組載體命名為pCMV-Myc-MT2A.同樣方法構建含BamHI和EcoRI酶切位點的原核重組表達載體pET-DsbA-MT2A.

1.2.3融合蛋白的表達及純化

將pGEX-4T-1-GALNT14、pET-DsbA-MT2A及空載體pGEX-4T-1、pET-DsbA分別轉化感受態大腸桿菌BL21,挑單克隆于3 mL LB培養液中培養過夜,以10%接種量接種于5 mL LB中,37 ℃、220 r/min培養約2.5 h,至OD600為0.6～0.8,加入誘導劑IPTG(終濃度1 mmol/L),37 ℃、180 r/min誘導2 h.誘導結束后以12 000 r/min、4 ℃離心2 min，收集菌體.取適量菌體,加入細胞裂解液,充分重懸,超聲破碎后,12 000 r/min、4 ℃離心20 min,輕輕吸取上清液.

按Glutathione-Sepharose 4B及鎳柱的操作說明書進行蛋白純化,獲得結合有GST-GALNT14融合蛋白或GST蛋白的Glutathione-Sepharose 4B小顆粒和純化好的His-DsbA-MT2A及His-DsbA蛋白.

1.2.4His-DsbA-MT2A與GST-GALNT14的蛋白沉降實驗(GST pull-down)

分別吸取上述吸附有GST-GALNT14和GST蛋白的Glutathione-Sepharose 4B顆粒20 μL (約含目的蛋白1.5 μg) 和1 μg pET-DsbA-MT2A加入到500 μL 1×結合緩沖液 (PBS pH 7.3,1 mmol/L DTT,1 g/L NP-40,蛋白酶抑制劑)中,4 ℃結合4 h.同時以His-DsbA蛋白做為陰性對照.用結合緩沖液洗Sepharose小顆粒5次,每次10 min,棄上清液,洗脫未結合的蛋白.向上述洗脫完畢的Sepharose小顆粒加入1×上樣緩沖液,沸水浴5 min,進行SDS-PAGE電泳.用抗His標簽抗體進行Western blotting分析.

1.2.5免疫共沉淀(Co-IP)

用于轉染的pCMV-Myc-MT2A、pcDNA3.1-Flag-GALNT14及空載體用無內毒素小量質粒提取試劑盒進行提取,具體操作步驟按照試劑盒內說明書進行.pCMV-Myc-MT2A與pCDNA3.1-Flag-GALNT14共轉染MCF-7細胞.轉染24～36 h后,使用NP-40裂解液裂解細胞,收獲細胞總蛋白(total lysate).取30 μL做為Western blot的對照(稱為lysate).按BCA蛋白定量試劑盒說明書進行蛋白定量.

取1 mg細胞總蛋白,加入1 μg的IP用抗體 (抗c-Myc,兔源),4 ℃搖3 h.加入40 μL proteinA/G-agarose,4 ℃搖過夜 (8 h以上).4 ℃、3 000 r/min離心5 min,棄上清液,留取agarose沉淀.加入1 mL細胞裂解液洗滌沉淀.4 ℃搖10 min.4 ℃、3 000 r/min離心5 min,重復洗滌沉淀共4遍.洗過的agarose沉淀重懸于50 μL 1×上樣緩沖液.100 ℃煮5 min,4 ℃、3 000 r/min離心5 min,上清液稱為IP.取抗體沉淀的上清液及預留的細胞裂解液同時進行SDS-PAGE 電泳,電泳結束后將蛋白電轉印至硝酸纖維素膜,然后進行Western blotting,細胞裂解液及IP上清液均同時用c-Myc標簽抗體(鼠源)和FLAG標簽抗體(鼠源)檢測.

2結果

2.1表達載體構建

以293T cDNA文庫為模板,釣取了186 bp長的MT2A cDNA編碼序列,并成功構建pCMV-Myc-MT2A及pET-DsbA-MT2A表達載體,測序結果正確.

2.2融合蛋白的表達及純化

以重組表達質粒pGEX-4T-1-GALNT14及pET-DsbA-MT2A和空載體分別轉化大腸桿菌BL21,經IPTG誘導后可見明顯誘導表達帶(圖1).純化后,獲得了較高純度的與預期分子質量一致的融合蛋白(圖2).

a.GST-GALNT14在BL21中的表達情況.1,2.轉化pGEX-4T-1空載體的BL21誘導前及誘導后全菌；3,4.pGEX-4T-1-GALNT14誘導前及誘導后全菌；5,6.pGEX-4T-1-GALNT14誘導上清液及誘導沉淀，在誘導后可見GST和GST-GALNT14蛋白的明顯誘導條帶.b.His-DsbA-MT2A在BL21中的表達情況.1，4.pET-DsbA-MT2A誘導后及誘導前全菌；2,3.pET-DsbA-MT2A誘導上清液及誘導沉淀；5,6.轉化pET-DsbA空載體的BL21誘導前及誘導后全菌，在誘導后可見His-DsbA和His-DsbA-MT2A蛋白的明顯誘導條帶.M.蛋白質分子質量標準(ku).圖1　GALNT14和MT2A誘導表達的SDS-PAGE電泳Fig.1　SDS-PAGE electrophoresis analysis of the induction of GALNT14 and MT2A

a.GST-GALNT14及GST蛋白的純化結果.1.GST；2.GST-GALNT14蛋白；b.His-DsbA-MT2A及His-DsbA蛋白的純化結果.1.His-DsbA-MT2A；2.His-DsbA蛋白.M.蛋白質分子質量標準(ku).圖2　GALNT14及MT2A純化的SDS-PAGE電泳Fig.2　SDS-PAGE electrophoresis analysis of the purification of GALNT14 and MT2A

2.3蛋白沉降實驗(GST pull-down)

將GST-GALNT14純化蛋白或GST蛋白分別與純化的His-DsbA-MT2A混合后進行GST pull-down實驗.同時以His-DsbA作對照.結果表明(圖3),His-DsbA-MT2A能與GST-GALNT14結合,而不與GST結合,而且GST-GALNT14也不與His-DsbA結合,說明MT2A在體外能特異性結合GALNT14.

圖3　MT2A與GALNT14在體外的相互作用Fig.3　Interaction between GALNT14 and MT2A in vitro

2.4免疫共沉淀(Co-IP)

1.實驗組(共轉染pCMV-Myc-MT2A/pCDNA3.1-Flag-GALNT14)細胞裂解液；2.對照組(共轉染pCMV-Myc/pCDNA3.1-Flag-GALNT14)細胞裂解液；3.實驗組IP裂解液；4.對照組IP裂解液.圖4　GALNT14與MT2A在MCF7細胞內的相互作用Fig.4　Interaction between GALNT14 and MT2A in MCF7 by Co-IP assay

將帶有Myc標簽的MT2A和帶有FLAG標簽的GALNT14質粒共轉染MCF-7細胞,同時轉pCMV-Myc空質粒和GALNT14質粒做陰性對照.用抗Myc抗體(兔源)免疫沉淀(IP) Myc-MT2A,用抗FLAG抗體(鼠源)做Western blotting分析,檢測免疫沉淀復合物中是否含有GALNT14.結果表明,用抗Myc抗體可以將Flag-GALNT14從共轉pCMV-Myc-MT2A和pCDNA3.1-Flag-GALNT14的細胞裂解液中沉淀下來,用抗FLAG抗體可檢測到Flag-GALNT14,而共轉染pCMV-Myc空載體和pCDNA3.1-Flag-GALNT14的IP裂解液用抗FLAG抗體檢測無信號(圖4).結果表明GALNT14可以與MT2A結合,而不與Myc標簽結合,說明MT2A和 GALNT14在體內存在特異性的相互作用.

3討論

GALNT14隸屬于乙酰氨基半乳糖苷轉移酶家族[17],可調控腫瘤細胞的侵襲及轉移能力[21],GALNTases酶家族作為O-糖基的起始酶對腫瘤中出現的異常糖基化起著重要作用.為深入研究GALNT14的功能,揭示其在腫瘤發生發展中的作用機制,發現新的GALNT14相互作用蛋白提供有益的幫助.

本研究室前期利用酵母雙雜交技術篩選獲得MT2A與GALNT14存在相互作用.MT2A為金屬硫蛋白(metallothionein,MT)的一個功能性基因[22],是一類普遍存在的低分子質量(6 ～7 ku)、富含半胱氨酸、高金屬含量的金屬結合蛋白[23].MT對維持一些必需金屬的體內代謝平衡[24-25]、抵抗有毒金屬毒性[25-26]及自由基的清除[27-28]有重要意義.MT參與腫瘤細胞凋亡[29]、增殖和分化[30]以及化療耐藥[31].MT2A的mRNA在乳腺癌組織中轉錄水平最高,并且和細胞增殖、組織分級呈正相關[32].組織學分級為3級的腫瘤,其MT2A mRNA表達水平明顯高于組織學分級為1、2級腫瘤的MT2A mRNA表達水平.Bay等[33-34]研究了MT在乳腺肌上皮細胞中表達的意義.肌上皮細胞含有較多的蛋白酶抑制劑,它們可能起到抑制乳腺癌的血管增生、減少入侵和轉移的作用.根據這些信息,推測MT2A與GALNT14相互作用的可能性極大.酵母雙雜交技術是一種非常有效的篩選蛋白質相互作用的方法,但也有不完善之處,特別是不能排除由于酵母生物本身特性而產生的非真實相互作用.為此,本文利用Co-IP和GST pull down在體內外對其相互作用進行進一步驗證.首先構建了MT2A的原核和真核表達質粒,然后通過MT2A和GALNT14在原核系統的表達并純化蛋白,進行蛋白沉降實驗(pull-down)；并進一步將MT2A和GALNT14共轉染MCF-7細胞,進行免疫共沉淀實驗(Co-IP).結果顯示GALNT14在體內外環境下都可以有效地結合MT2A,說明了它們之間相互作用的可靠性.根據實驗結果推測GALNT14在發揮促進腫瘤細胞侵襲轉移的過程中可能涉及MT2A的參與,但具體參與調控GALNT14作用的方式有待于進一步的研究與探索.

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(責任編輯：趙藏賞)

Validation of the interaction of GALNT14 and MT2A

ZUO Tao,LIU Xuemin,SHAN Jinshuai,TANG Jingzhen,WU Chen

(College of Life Sciences,Hebei University,Baoding 071002,China)

Abstract:Co-immunoprecitipation assay and GST pull-down assay were applied to validate the interaction of GALNT14 and MT2A in vivo and in vitro.The cDNA fragment of MT2A was cloned into pET-DsbA and pCMV-Myc.His-Dsba-MT2A and GST-GALNT14 were expressed and purified,and the results of GST pull-down assay showed that MT2A could bound with GALNT14,which confirmed the directly interaction between them in vitro.Then pCMV-Myc-MT2A and pCDNA3.1-Flag-GALNT14 were co-transfected into human breast cancer cell MCF-7.The results of Co-IP illustrated that anti-Myc antibody can precipitated GALNT14 from cell lysates,which revealed MT2A interacted with GALNT14 in vivo.The results showed that GALNT14 could bind MT2A and interact with each other directly in vivo and in vitro,which provided some promising clue for the further exploration into the function of GALNT14.

Key words:N-acetylgalactosaminyltransferase 14(GALNT14);metallothionein 2A(MT2A);GST pull-down assay(GST pull-down);co-immunoprecitipation analysis(Co-IP)

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2016.01.011

收稿日期：2015-06-12

基金項目：河北省自然科學基金資助項目(C2013201112)；河北省教育廳優秀青年基金資助項目(Y2012024)

通信作者：吳琛(1977—),女,河北保定人,河北大學教授,博士,主要從事腫瘤分子生物學研究.

中圖分類號：Q78

文獻標志碼：A

文章編號：1000-1565(2016)01-0065-07

第一作者：左濤(1989—),男,河南魯山人,河北大學在讀碩士研究生.E-mail：zuotao1123@163.com

E-mail：dawnwuchen@163.com