新型基因編輯技術CRISPR/Cas9系統研究現狀

騫蕾陽,周志軍,常巖林

(河北大學生命科學學院，河北省無脊椎動物系統學與應用重點實驗室,河北保定　071002)

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新型基因編輯技術CRISPR/Cas9系統研究現狀

騫蕾陽,周志軍,常巖林

(河北大學生命科學學院，河北省無脊椎動物系統學與應用重點實驗室,河北保定071002)

摘要：規律成簇間隔短回文重復序列及其相關系統(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated,CRISPR/Cas system)是細菌和古細菌防御外來噬菌體、質?；蚱渌庠碊NA侵染的獲得性免疫系統.依據Cas蛋白種類和同源性,CRISPR/Cas系統被分為3類,其中,Ⅰ類和Ⅲ類需要多種Cas蛋白參與,而Ⅱ類系統,即CRISPR/Cas9組成簡單,僅需Cas9蛋白參與即可.經過遺傳工程改造后的CRISPR/Cas9已經作為一種新型的基因編輯工具被用于多種生物的基因組編輯.本文就CRISPR/Cas9系統的發現、結構組成、作用機制、研究現狀、面臨的困境及應用前景等幾方面進行了總結.

關鍵詞：基因編輯；CRISPR/Cas9系統；CRISPR干擾；干擾機制；基因治療

基因編輯(gene editing)技術是指在基因組水平進行基因定點插入/缺失突變、敲除、多位點同時突變和小片段刪除等精確操作的技術.目前,已報道的基因編輯技術包括鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFN)[1-2]、類轉錄激活因子核酸酶(transcription activator like effector nucleases,TALEN)[3-6]和新近興起的CRISPR/Cas9[7-9],3種核酸內切酶都可以特異性識別、切割靶DNA序列,引起DNA雙鏈斷裂(DSB).其中,ZFN與TALEN復合體由多個酶亞基組成,分別執行靶DNA序列識別與內切活性.ZFN和TALEN技術都需要針對不同靶DNA序列重新構建切割工程酶,任務繁重且容易出錯.CRISPR/Cas9系統是一種新興的基因編輯技術,僅由CRISPR-derived RNA(crRNA)、反式激活crRNA(trans-activating crRNA,tracrRNA)和Cas9核酸內切酶3個元件組成[10],依靠簡單的向導RNA(single-guide RNA,sgRNA)實現靶DNA序列識別,可以通過對sgRNA進行簡單修改完成不同基因的靶向編輯[11-12].該系統目前已成功應用于多種生物的基因組編輯,極大地促進了功能基因研究[8]1266.本文就CRISPR/Cas9系統的發現、結構組成、作用機制、研究現狀、面臨的困境及應用前景等幾方面進行了總結.

1CRISPR/Cas系統發現與結構組成

規律成簇間隔短回文重復序列及其相關系統(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated,CRISPR/Cas system)[13]存在于大約50%的細菌和90%的古細菌基因組中[14],是細菌和古細菌抵御外來噬菌體、質?；蚱渌苿釉15]侵染的獲得性免疫系統[14,16-20].CRISPR位點最早由Ishino等[21]在大腸桿菌Escherichiacoli堿性磷酸酶基因iap的側翼序列中發現.Bult等[22]描述了產甲烷古細菌Methanocaldococcus(Methanococcus)jannaschii基因組中的18個CRISPR位點.直至Jansen等[23]對40余種原核生物基因組中的CRISPR位點進行描述后被正式命名.此后,多項研究發現CRISPR中的間隔區(spacer)與侵染細菌的病毒、質粒等外源核酸序列一致[24-26],Makarova等[27]提出CRISPR具有免疫防御作用的假說.Barrangou等[28]發現嗜熱乳酸鏈球菌Streptococcusthermophilus的CRISPR可以通過從侵染的噬菌體基因組上獲取新的間隔DNA序列,從而獲得對該噬菌體的特異性免疫能力.

CRISPR由1個前導序列(Leader)、多個短而保守的重復序列區(Repeat)和多個間隔區(Spacer)組成[27,29-31](圖1).Leader位于上游,沒有編碼活性,可能是CRISPR簇的啟動子序列,具有物種特異性.不同系統的Repeats長度為23～47 bp,在同一個CRISPR排列中,Repeats是高度保守的,而且在一些近緣種間也具有一定相似性[14].Spacers是噬菌體或質粒侵入后留下的痕跡,從而賦予細胞獲得對相應的噬菌體和質粒的免疫防御能力.在同一個CRISPR排列中,位于2個Repeats之間的Spacers長度相似,但序列不同[14-15,20].預測HaliangiumochraceumDSM 14365擁有最長的CRISPR序列,587個Spacers僅2個相同[15].

圖1　 細菌及古細菌中CRISPR系統的基因座組成[8]1267Fig.1　 CRISPR loci in bacteria and archaea

cas基因位于CRISPR位點附近,主要編碼核酸酶和DNA解旋酶等切割修飾核酸的相關的Cas蛋白[14,32].Cas是基因組剪輯和基因調控的強有力工具[19].根據CRISPR/Cas系統中Cas蛋白的種類和同源性,可將CRISPR/Cas系統區分成Ⅰ～Ⅲ 3種類型[14-15,33],Ⅰ型系統在細菌和古細菌中都有發現；Ⅱ型系統僅在細菌中發現；Ⅲ型系統主要發現于古細菌和少數細菌之中.根據cas基因的遺傳信息以及所編碼蛋白的結構和功能的多樣性,這3種類型可分為12種亞型.它們的保守中心包括cas1到cas6 6個基因,其中cas1和cas2 是3種CRISPR/Cas系統的共有基因[14,34],而cas3、cas9和cas10 是特定的“標記”基因[32].cas1、cas2基因和Cas1蛋白對crRNA的生物合成以及靶向等與CRISPR相關的過程是不可缺少的.Cas1以序列獨立的方式緊緊結合于dsDNA,Cas1和 Cas2是金屬依賴性核酸內切酶,Cas1能夠將dsDNA切割成短片段[32].多個CRISPR/Cas系統可共存于單個基因組,每套cas基因跟各自的CRISPR基因座功能相關[14].

2CRISPR/Cas9系統的免疫干擾機制及基因工程改造

目前,CRISPR/Cas9的研究最為深入,通過對SpyCas9 和AnaCas9 的結構分析確定了Cas9酶家族的分子構架,1個保守的結構中心包含RuvC和HNH 2個結構不同的核酶區域[33],分別負責切割目標DNA的2條鏈,同時也包含識別5′-NGG或5′-NAG 等與原間隔區臨近基序(protospacer adjacent motif,PAM)[35-37]的結構.Cas9酶在apo狀態下接收并催化不活躍的構象,DNA識別和切割也需要構象激活[38].

CRISPR/Cas9系統的作用機制分為3個階段：間隔序列獲取,crRNA表達、加工和成熟,免疫干擾[32-34].當噬菌體或質粒首次侵染細菌或古細菌時,Cas9核酸內切酶通過PAM信號識別并切割靶向DNA序列[15,19,39],酶切產生的DNA短片段被插入到前導序列和第1個重復序列之間,并伴隨重復序列復制[40].當該噬菌體或質粒再次侵染細菌或古細菌時,在前導序列調控下,CRISPR被轉錄生成crRNA前體(pre-crRNA),Cas操縱子上游與pre-crRNA重復序列互補的tracrRNA也被同時轉錄合成[41],tracrRNA能夠激發Cas9和雙鏈RNA特異性RNase Ⅲ核酸酶對pre-crRNA進行加工,形成包含保守重復序列和間隔區的成熟crRNA[14,39,42].crRNA與tracrRNA通過堿基配對結合形成雙鏈RNA[42-43],并與Cas9結合形成復合體[44].該復合體識別并結合與crRNA互補的靶DNA序列,使其雙鏈解開形成R-loop,Cas9的HNH核酶區識別、切割與crRNA配對的靶DNA互補鏈；而RuvC核酶區切割處于游離狀態的非互補鏈[19,29,44-45](圖2),最終在靶DNA中PAM上游3nt 處雙鏈斷裂(double strand broken,DSB).

圖2　CRISPR/Cas9免疫干擾示意[45]248　Fig.2　diagram of CRISPR/Cas9 immune interference

經過遺傳工程改造的CRISPR/Cas9系統已作為一種新型的基因編輯工具被廣泛使用[46].該系統僅包括1個Cas9蛋白和1條sgRNA[47],其中,sgRNA由tracrRNA和crRNA融合形成.Cas9 蛋白作為核酸酶切割雙鏈DNA,而sgRNA則通過堿基互補配對決定靶序列的特異性,靶序列可以是DNA雙鏈的任意鏈.基因組中的靶DNA序列與crRNA存在約20 bp的互補配對區,靶DNA序列3′末端的PAM(5′-NGG-3′)為Cas9識別位點,不能包含在sgRNA之中,切割導致靶DNA雙鏈斷裂[37,48-49].雙鏈斷裂后的靶DNA通過HR或NHEJ途徑修復,以NHEJ為主,該方式較HR出錯率更高.修復過程將在靶DNA序列引入插入/缺失突變[35,50-51],修復完成后,CRISPR/Cas9系統將再次作用于那些沒有引入突變的靶DNA序列[11].利用載體,或通過與CPP(cell-penetrating peptide)連接/絡合的方式將Cas9蛋白和sgRNA導入受體細胞,或直接將編碼Cas9蛋白和sgRNA的mRNA注入受精卵等方法,快速生成靶向突變個體.CRISPR/Cas9系統在靶向編輯新的基因位點時,無需重新構建核酸內切酶,僅需根據靶基因序列對sgRNA做少許修改即可,相比于其他基因組編輯技術,靶向突變新基因位點的效率顯著提高[52].CRISPR/Cas9系統不僅可以靶向編輯單個基因,而且可以組合多條sgRNA同時完成多個基因位點的靶向編輯.Cong等[53]基于在細菌/古細菌基因組中CRISPR系統基因座的間隔序列排列形式,最先使用單一CRISPR/Cas9系統同時完成了EMX1和PVALB的靶向編輯,并利用CRISPR/Cas9系統形成雙鏈斷裂完成了EMX1的大段刪除.Mali等[54]對人基因組中潛在的sgRNA資源進行了估算,發現約190 kb獨特的sgRNA 可以靶向約40.5%外顯子.

3CRISPR/Cas9系統在介導基因敲除研究中的應用

CRISPR/Cas9系統作為一種最新涌現的基因編輯工具,由于能夠完成RNA導向的DNA識別及編輯,為構建更高效的基因定點修飾技術提供了全新平臺.除在細菌中被廣泛使用之外,CRISPR/Cas9系統還被用于人、老鼠、斑馬魚、果蠅、酵母、線蟲和農作物細胞內目標基因的刪除、插入、激活或抑制.

3.1CRISPR/Cas9系統在植物基因敲除研究中的應用

CRISPR/Cas9系統已在擬南芥、煙草、水稻、玉米、高粱、小麥、甜橙和番茄等多個植物物種中得到了應用.地錢Marchantiapolymorpha被認為是研究陸生植物進化的理想模型.Sugano等[55]利用CRISPR/Cas9系統對地錢編碼生長素應答因子1(ARF1)進行了定點突變.在該項研究中,地錢的U6啟動子(MpU6-1pro)被用于構建針對ARF1基因設計sgRNA序列的表達載體；而經人類密碼子優化后的hCas9則被35Spro或自身MpEFpro驅動過表達.利用農桿菌轉化法將含有hCas9和sgRNA的表達載體導入地錢萌芽孢子.通過1-萘乙酸(NAA)和潮霉素篩選hCas9和sgRNA同時表達的轉導細胞,并通過RFLP多態性分析最終證實在NAA中存活的地錢ARF1靶位點存在突變.Feng等[56]利用農桿菌侵染方法穩定轉化擬南芥和水稻,除SPP sgRNA1僅5%之外,突變效率達26%～84%.Zhang等[57]將CRISPR/Cas9系統用于水稻riceoutermostcell-specificgene5(ROC5),stromalprocessingpeptidase(SPP) 和youngseedlingalbino(YSA)基因編輯.針對上述目的基因設計sgRNA,使用水稻自身的U6RNAs啟動子表達sgRNA.使用的hSpCas9優化編碼序列由CaMV35S啟動子驅動.為提高轉運效率,sgRNA和hSpCas9被亞克隆到同一表達載體中,通過農桿菌轉化法導入水稻組織培養中[56].被編輯的基因能夠傳遞到下一代,在第1代水稻中出現了所編輯的目標基因的純合體.表明CRISPR/Cas9系統可以有效地誘導水稻中目標基因的編輯.Zhou 等[35]利用CRISPR/Cas9系統在水稻原生質體中實現115～245 kb 長染色體大片段(包含2～3 個不同的基因簇)刪除.

3.2CRISPR/Cas9系統在構建人類疾病動物模型中的應用

人類疾病動物模型對病理研究及臨床治療非常重要.CRISPR/Cas9系統是繼鋅指核酸酶(ZFN)、ES 細胞打靶和 TALEN 等技術后,又一種可用于定點構建基因敲除大、小鼠動物的方法,且有效率高、速度快、生殖系轉移能力強及簡單經濟的特點,在許多人類重要疾病動物模型構建的應用前景非常廣闊.Li等[58]使用CRISPR/Cas9系統構建了Uhrf2基因敲除小鼠模型,Mc3R和Mc4R雙基因敲除的大鼠和小鼠模型.研究結果證明通過向小鼠受精卵中注射編碼CRISPR-Cas系統的mRNA比DNA在胚胎中產生定點突變的效率更高；且不受小鼠遺傳品系限制,能夠對基因組的大片段DNA進行刪除；同時注射針對不同基因設計的sgRNA序列能夠在同一只小鼠(或大鼠)中產生多個基因突變.

Yoshimi等[59]將Cas9 mRNA和靶向大鼠毛色相關的絡氨酸酶基因(Tyr)的sgRNA顯微注射入Wistar大鼠受精卵雄性原核,PCR擴增分析發現41.2%的Tyr位點表現出大量插入/缺失突變.將Cas9-sgRNA處理后的2細胞期胚胎轉移到代孕母體中,幼鼠DNA序列分析發現Tyr位點都攜帶插入/缺失突變,并且Tyr位點都是雜合或嵌合式的,說明Cas9-sgRNA介導的突變能夠穩定地傳遞到下一代.將針對Tyrc基因的sgRNA、Cas9 mRNA和80 bp的TyrC等位基因的單鏈寡聚脫氧核糖核酸(single stranded oligodeo xynucleotide,ssODN)同時注入F344大鼠胚胎,結果發現,7.7%的子代個體不再是白化皮毛,成為頭部有顏色的非刺鼠.序列分析發現23.1%的幼鼠的Tyr位點有插入缺失突變,7.7%的幼鼠有精確的單核苷酸多態性交換.

3.3CRISPR/Cas9系統在人細胞系基因組編輯中的應用

Sakuma等[18]研究表明由Cas9和多個sgRNA 形成的復合CRISPR/Cas9系統可同時編輯多個靶基因,將經過修改同時表達Cas9核酸酶和7個sgRNA的pX330導入人HEK293T細胞.PCR分析表明：同時表達7個sgRNA的復合CRISPR/Cas9系統的誘導突變效率與表達單個sgRNA的系統相同.Ramakrishna等[60]在Cas9 的C端添加了1個半胱氨酸Cys,通過Cys游離的SH殘基與轉膜肽(cell-penetrating peptide,CPP)第1個氨基形成硫醚鍵(4-maleimidobutyryl-4G9R4L,m9R)連接形成Cas9-m9R；sgRNA和9R(包含1個Cys,3個Gly,9個Arg,4個 Leu和 1個Cys的CPP)在一定的比例下混合形成帶正電的納米粒子.通過將Cas9和sgRNA與CPP連接(或混合)促進Cas9和sgRNA跨膜轉運進入人HEK293T細胞、HeLa細胞和 NCCIT細胞、皮膚纖細胞和胚胎干細胞對CCR5基因進行突變.

3.4CRISPR/Cas9系統在插入標簽基因研究中的應用

Cas9對DNA 雙鏈的切割分別由2個功能結構域執行,1個結構域突變后的Cas9成為僅能切割DNA 1條鏈的切口酶,通過引入修復模板,以極低的突變活性完成同源定向修復,顯著降低了Cas9 切割雙鏈引起的隨機突變概率[53].Zhang等[61]利用CRISPR/Cas9系統對約氏瘧原蟲絲氨酸蛋白酶基因Pysera1進行編輯,構建1個包含46 bp標簽DNA的質粒pYC-Pysera1,Pysera1的2個純合區域被此DNA序列隔開.針對Cas9-sgRNA介導的可能導致突變的靶位點,設計了2個sgRNA靶向Pysera1外顯子2的3′端,形成質粒pYC-sera1-sgRNA1和pYC-sera1-sgRNA2.通過電轉化將質粒導入P.yoelii17XNL菌株.親本17XNL和轉染質粒的約氏瘧原蟲基因組DNA的PCR分析表明,在sgRNA1和sgRNA2的指導下,左右2個純合臂在特定位點成功融合.熒光蛋白或報告基因標記技術常被用于研究蛋白質亞細胞分布和相互作用,利用CRISPR/Cas9系統能夠在約氏瘧原蟲內源基因Py03652中插人熒光蛋白基因gfp,首先構建pYC-Py03652-gfp,在Py03652基因開放閱讀框的3′端(710 bp)與3′端非編碼區(779 bp)之間插入gfp基因.Py03652基因編碼早期的轉錄膜蛋白.針對需要插入的熒光蛋白基因,設計sgRNA,構建載體pYC-Py03652-gfp-sgRNA.轉染后,獲得報告基因與Py03652基因3′末端融合的基因重組寄生蟲.通過熒光激活細胞分選分析發現,38%的細胞存在綠色熒光蛋白的表達.

3.5CRISPR/Cas9系統在功能基因研究中的應用

基于CRISPR/Cas9系統發展而來的CRISPR干擾(CRISPRi)技術是一種新的、高度特異性的工具,該技術能夠在不改變DNA序列的情況下,通過阻遏轉錄的延伸和RNA聚合酶的結合來實現類似RNAi的效果[62].目前,CRISPRi技術已經被成功地用于細菌、酵母、小鼠、人類等多種模式生物的功能基因轉錄調控研究[19,62].通過突變使Cas9的2個核酶區域失活,形成可以與靶DNA結合但沒有核酶活性的缺陷Cas9(dCas9),dCas9在sgRNA的指導下與靶DNA啟動子結合,特異性阻止RNA聚合酶與該啟動子序列結合或作為轉錄終止子阻斷RNA聚合酶的繼續運行[63].dCas9與sgRNA復合體靶向乳糖途徑的調控基因和結構基因,能夠出現所需要的表型.利用該平臺,在sgRNA的指導作用下,dCas9與轉錄抑制結合位點相互作用能夠激活基因表達.通過將特定的轉錄激活因子和抑制因子與Cas9復合體融合,能夠精確地激活或沉默基因表達.如果對CRISPR轉錄因子(Cas9轉錄效應物區域融合蛋白)和sgRNA重編程,能夠對靶位點的基因表達產生預期的影響.順著基因啟動子區域,利用多個sgRNA靶向多個位點能夠調節這種效果[63].在細菌細胞中,這種沉默可以逆轉且具有可誘導性和高度特異性,通過在sgRNA堿基配對區域引入1個或幾個錯配堿基,或與基因不同區域靶向作用以調節抑制效率.多條sgRNA可以同時調控多個基因表達,也可以協同地控制單個基因以加強抑制或調整基因表達的抑制水平[64].基因治療(gene therapy)指將外源正常基因導入靶細胞,以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病,以達到治療目的.Gilbert等[65]利用CRISPRi技術抑制人HeLa細胞的轉鐵蛋白受體(CD71)和C-X-C趨化因子受體(CXCR4)基因表達.針對靶基因編碼區雙鏈設計的10個sgRNA橫跨轉錄起始點的上、下游500 bp,3/10的sgRNA抑制率達60%～80%,RNA 測序表明CRISPRi介導的轉錄抑制具有很高的靶向特異性.Feng等[66]通過電轉化將綠色熒光蛋白融合表達載體U6sgRNA-Cas9-2A-GFP導入人骨肉瘤KHOS和U-2OS細胞系,結果顯示CRISPRi技術可以顯著抑制CDK11蛋白表達.羅斌[67]發現CRISPRi技術可以下調人肺癌細胞系A549中乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase,LDHA)基因的mRNA和蛋白表達水平,抑制癌細胞增殖.

4CRISPR/Cas9系統應用的影響因素

4.1脫靶效應

CRISPR/Cas9不僅靶向編輯目標DNA位點,而且也會切割那些與靶位點序列相同(或高度相似)的其他DNA位點,使其產生突變,即脫靶效應(off-target effect)[62].脫靶效應是基于CRISPR/Cas9的基因編輯技術所面臨的最主要問題.

首先,由于Cas9蛋白對sgRNA 5′端序列與靶位點間的錯配不敏感,其脫靶風險較ZFN和TALEN方法更高.為了提高靶向特異性,研究人員通過點突變滅活核酸內切酶結構域(RuvC-Ⅰ)構建了1種僅切割靶DNA單條鏈的突變型Cas9蛋白(Cas9 D10A).為了形成靶DNA雙鏈斷裂,需要2條sgRNA同時引導Cas9 D10A識別并切割靶DNA雙鏈的相鄰位置.這種突變后的“雙切口酶”產生雙鏈斷裂效率和野生型Cas9相同,但由于2個sgRNA 具有加倍的識別序列長度,因此可以極大降低脫靶突變,特異性提高50～1 500倍,顯著提高了靶位點的特異性[53-54,62-63].

其次,PAM序列也可影響CRISPR/Cas9介導的基因組編輯效率和特異性.CRISPR/Cas9作用于靶DNA序列,不僅依賴sgRNA的指導,而且與入侵DNA序列中和crRNA靶序列連接的2～5 nt 的PAM序列有關[33].不同來源的Cas9蛋白識別不同的PAM序列,如：釀膿鏈球菌PAM為NGG,腦膜炎雙球菌的PAM為N-GGNG和 NNAGAAW[62].CRISPR/Cas9在基因組編輯中的特異性與Cas9蛋白識別的PAM序列長度有關.一般而言,CRISPR/Cas9脫靶突變率隨PAM序列增長而降低,其原因主要是不同長度的PAM序列在基因組中潛在的靶位點數目不同,如：PAM NGG和NAG在基因組中很可能每8 nt可以發現1個靶位點,而NGGNG和NNAGAAW則分別要每32 nt和256 nt 才有1個靶位點[62].延長PAM序列雖然能夠提高CRISPR/Cas9靶向特異性,但卻限制了靶DNA序列中潛在作用位點數目.在具體研究中,CRISPR/Cas9系統需要根據靶基因選擇不同的PAM.參考基因組數據將有助于合適的靶位點篩選.

再次,CRISPR/Cas9用量與脫靶效應產生相關,雖然減小sgRNA用量可以降低脫靶效應,但不利于靶基因斷裂.因此在高目標效應和低脫靶效應之間存在一個最優平衡點,在實際應用中需要進行優化.

最后,sgRNA在基因組中潛在互補位點多少與脫靶效應有關,每個基因都有成百上千的位點可以進行編輯,通過選擇潛在互補位點少的區域設計合成sgRNA可以降低脫靶效應,提高CRISPR/Cas9特異性[62].通過優化sgRNA 設計可以提高該系統的成功率和突變效率.為了尋找到最佳的基因組序列設計sgRNA,Hsu等[68]建立了一個Web版的、可以識別幾乎任何一個基因計算機模型幫助研究人員尋求最佳編輯位點.Xiao等[69]報道了一個本地版的潛在脫靶位點分析軟件CasOT,該軟件包可以識別任意基因組或序列中的潛在脫靶位點.

4.2sgRNA的設計合成和效率

sgRNA的指導效率是限制CRISPR/Cas9系統應用的另一個重要因素.一些人工設計合成的sgRNA指導效率低下可能與靶DNA位點所處的染色質狀態及sgRNA發夾結構等因素有關[62].RNA聚合酶Ⅱ轉錄生成的mRNA需要經過復雜的轉錄后加工和修飾過程,mRNA形成后會被轉運至細胞質,而Cas9/sgRNA僅僅用于核基因組DNA,目前尚沒有找到使用RNA聚合酶Ⅱ生成sgRNA的方法.目前體內生成sgRNA主要依賴RNA聚合酶Ⅲ、U3snRNA和U6snRNA啟動子.由于U3snRNA和U6snRNA作為管家基因,在各種組織中均有表達,無法特異性地在某種細胞和組織中產生sgRNA；而且對很多生物的U3和U6啟動子都缺少研究,缺乏商業化的RNA聚合酶Ⅲ,都在一定程度上限制了基于U3和U6啟動子生成sgRNA[62].Gao等[70]設計了1個可以被任何啟動子轉錄的人造基因RGR,該基因最初轉錄生成1個2端具有核酶序列的sgRNA分子,經自我催化切割形成成熟的sgRNA分子,之后便可成功地誘導體外和酵母內的序列特異性切割.這樣,如果選擇合適的啟動子,就會允許細胞和組織特異性基因組編輯.Heigwer等[71]報道的Web版sgRNA設計軟件E-CRISP使用序列比對軟件Bowtie2可評估脫靶效應和靶位點同源性.

4.3CRISPR/Cas9組件轉移方式有限

在利用CRISPR/Cas9系統進行基因組靶DNA序列編輯時,如何將Cas9蛋白和sgRNA轉運至靶細胞中至關重要.通過農桿菌轉化法(agrobacterium mediated transformation)使目的基因進入植物細胞,并將其插入到植物細胞的染色體DNA上,使目的基因的遺傳特性得以穩定維持和表達,是將目的基因導入植物細胞應用最廣的方法[55].對于動物細胞而言,雖然可以通過顯微注射技術將Cas9蛋白和sgRNA,或表達Cas9蛋白和sgRNA的mRNA注射入靶細胞,但顯微注射每次只能注射1個細胞,而且不同類型的靶細胞和組織轉染效率差異顯著[62].Ramakrishna等[60]將Cas9和sgRNA與CPP連接導入人胚胎干細胞、皮膚成纖維細胞、HEK293T細胞、HeLa細胞和胚胎癌細胞系.Wagner等[72],Jiang等[73]通過電轉化將編碼sgRNA和Cas9蛋白的質粒轉入靶細胞,實現了基因敲除,但電轉化效率要取決于細胞所處生長期.Gilbert等[65]通過慢病毒轉染將sgRNA和Cas9的表達載體導入受體細胞.但慢病毒表達時間較慢,熒光表達所需時間較長.此外,逆轉錄病毒載體只能感染分裂期細胞,而且容量有限,腺病毒一般不能整合到染色體上,只能進行瞬時感染.因此,在使用CRISPR/Cas9介導的基因編輯過程中仍然面臨可供選擇的范圍有限,今后需要進一步加強新的轉運工具開發以提高轉運效率.

5結語和展望

CRISPR/Cas9是繼ZFN和TALEN之后的第3代基因組編輯技術.這些根據DNA切割酶,即核酸酶開發的基因編輯技術針對特定靶基因訂制核酸酶難度極高,而CRISPR/Cas9系統的Cas蛋白不具有特異性,只需合成1個sgRNA即可實現對靶基因的特異性編輯.盡管由于發現時間較短,在脫靶效應、sgRNA設計以及組件轉運等方面存在一些應用瓶頸,但CRISPR/Cas9系統組成簡單,操作方便,價格低廉,操作周期短,突變效率高,堪稱基因組編輯技術的一次非常重要的技術革新[74],在基礎理論研究、綜合生物學和基因治療等領域研究中具有不可估量的應用前景[75].相信通過科研人員的不懈努力,CRISPR/Cas9基因組編輯技術的效率和特異性都會進一步提高,發展成為更可靠、方便的基因編輯工具[63],應用于農作物定向育種、快速闡明基因功能、構建人類疾病動物模型和基因治療(如血液病、腫瘤和其他遺傳疾病)等多個領域,快速對整個基因組進行功能篩選,幫助人們鑒定涉及特定疾病的基因,更好地了解疾病以及開發出新的治療方法,而CRISPR/Cas9 對誘導人多能干細胞的基因編輯和未來人類遺傳疾病的治療具有非常重要的應用前景.

參考文獻：

[1] DREIER B,FULLER R P,SEGAL D J,et al.Development of zinc finger domains for recognition of the 5'-CNN-3' family DNA sequences and their use in the construction of artificial transcription factors[J].Journal of Biological Chemistry,2005,280(42):35588-35597.DOI:10.1074/jbc.M506654200.

[2] BIBIKOVA M,GOLIC M,GOLIC K G,et al.Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc finger nucleases[J].Genetics,2002,161(3):1169-1175.

[3] TESSON L,USAL C,MENORET S,et al.Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs[J].Nature Biotechnology,2011,29(8):695-696.DOI:10.1038/nbt.1940.

[4] 沈延,肖安,黃鵬,等.類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALEN)介導的基因組定點修飾技術[J].遺傳,2013,35(4):395-409.DOI:10.3724/SP.J.1005.2013.00395.

SHEN Yan,XIAO An,HUANG Peng,et al.TALE nuclease engineering and targeted genome modification[J].Hereditas,2013,35(4):395-409.DOI:10.3724/SP.J.1005.2013.00395.

[5] 沈延,黃鵬,張博.TALEN構建與斑馬魚基因組定點突變的實驗方法與流程[J].遺傳,2013,35(4):533-544.DOI:10.3724/SP.J.1005.2013.00533.

SHEN Yan,HUANG Peng,ZHANG Bo.Aprotocol for TALEN construction and gene targeting in zebrafish[J].Hereditas,2013,35(4):533-544.DOI:10.3724/SP.J.1005.2013.00533.

[6] 楊翠翠,佟慧麗,馬興紅,等.利用TALEN技術在牛胎兒成纖維細胞中敲除Myostatin基因[J].遺傳,2014,36(7):685-690.DOI:10.3724/SP.J.1005.2014.0685.

YANG Cuicui,TONG Huili,MA Xinghong,et al.Myostatin knockout in bovine fetal fibroblasts by using TALEN[J].Hereditas,2014,36(7):685-690.DOI:10.3724/SP.J.1005.2014.0685.

[7] 殷利眷,胡斯奇,郭斐.CRISPR-Cas9基因編輯技術在病毒感染疾病治療中的應用[J].遺傳,2015,37(5):412-418.DOI：10.16288/j.yczz.14-460.

YIN Lijuan,HU Siqi,GUO Fei.The application of CRISPR-Cas9 gene editing technology in viral infection diseases[J].Hereditas,2015,37(5):412-418.DOI:10.16288/j.yczz.14-460.

[8] 李君,張毅,陳坤玲,等.CRISPR-Cas系統：RNA靶向的基因組定向編輯新技術[J].遺傳,2013,35(11):1265-1273.DOI:10.3724/SP.J.1005.2013.01265.

LI Jun,ZHANG Yi,CHEN Kunling,et al.CRISPR/Cas:a novel way of RNA-guided genome editing[J].Hereditas,2013,35(11):1265-1273.DOI:10.3724/SP.J.1005.2013.01265.

[9] 王延鵬,程曦,高彩霞,等.利用基因組編輯技術創制抗白粉病小麥[J].遺傳,2014,36(8):848.

[10] CHEN H F,CHOI J,BAILEY S.Cut site selection by the two nuclease domains of the Cas9 RNA-guided endonuclease[J].Journal of Biological Chemistry,2014,289(19):13284-13294.DOI:10.1074/jbc.M113.539726.

[11] SASAKI H,YOSHIDA K,HOZUMI A,et al.CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the ascidian Ciona intestinalis[J].Development Growth Differentiation,2014,56(7):499-510.DOI:10.1111/dgd.12149.

[12] BAKER M.Gene editing at CRISPR speed[J].Nature Biotechnology,2014,32(4):309-312.DOI:10.1038/nbt.2863.

[13] LI M H,YANG H H,ZHAO J,et al.Efficient and heritable gene targeting in tilapia by CRISPR/Cas9[J].Genetics,2014,197(2):591-599.DOI:10.1534/genetics.114.163667.

[14] NORAIS C,MOISAN A,GASPIN C,et al.Diversity of CRISPR systems in the euryarchaeal pyrococcales[J].RNA Biology,2013,10(5):659-670.DOI:10.4161/rna.23927.

[15] BISWAS A,GAGNON J N,BROUNS S J,et al.CRISPR target:bioinformatic prediction and analysis of crRNA targets[J].RNA Biology,2013,10(5):817-827.DOI:10.4161/rna.24046.

[16] SHEN B,ZHANG W S,ZHANG J,et al.Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects[J].Nature Methods,2014,11(4):399-402.DOI:10.1038/nmeth.2857.

[17] STERNBERG S H,REDDING S,JINEK M,et al.DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9[J].Nature,2014,507(7490):62-67.DOI:10.1038/nature13011.

[18] SAKUMA T,NISHIKAWA A,KUME S,et al.Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system[J].Scientific Reports,2014,4:5400.DOI:10.1038/srep05400.

[19] JINEK M,JIANG F G,TAYLOR D W,et al.Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation[J].Science,2014,343(6176):1215-1227.DOI:10.1126/science.1247997.

[20] AUER T O,BENE D F.CRISPR/Cas9 and TALEN-mediated knock-in approaches in zebrafish[J].Methods,2014,69(2):142-150.DOI:10.1016/j.ymeth.2014.03.027.

[21] ISHINO Y,SHINAGAWA H,MAKINO K,et al.Nucleotide sequence of the iap gene,responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion inEscherichiacoli,and identification of the gene product[J].Journal of Bacteriology,1987,169(12):5429-5433.

[22] BULT C J.Complete genome sequence of the methanogenic archaeon,Methanococcusjannaschii[J].Science,1996,273(5278):1058-1073.DOI:10.1126/science.273.5278.1058.

[23] JANSEN R,EMBDEN J D,GAASTRA W,et al.Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes[J].Molecular Microbiology,2002,43(6):1565-1575.DOI:10.1007/BF02490464.

[24] MOJICA F J,DIEZ-VILLASENOR C,GARCIA-MARTINEZ J,et al.Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements[J].Journal of Molecular Evolution,2005,60(2):174-182.DOI:10.1007/s00239-004-0046-3.

[25] POURCEL C,SALVIGNOL G,VERGNAUD G.CRISPR elements inYersiniapestisacquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA,and provide additional tools for evolutionary studies[J].Microbiology,2005,151(Pt 3):653-663.DOI:10.1099/mic.0.27437-0.

[26] BOLOTIN A,QUINQUIS B,SOROKIN A,et al.Clustered regularly interspaced short palindrome repeats(CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin[J].Microbiology,2005,151(Pt 8):2551-2561.DOI:10.1099/mic.0.28048-0.

[27] MAKAROVA K S,GRISHIN N V,SHABALINA S A,et al.A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes:computational analysis of the predicted enzymatic machinery,functional analogies with eukaryotic RNAi,and hypothetical mechanisms of action[J].Biology Direct,2006,1(1):1-26.DOI:10.1186/1745-6150-1-7.

[28] BARRANGOU R,FREMAUX C,DEVEAU H,et al.CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes[J].Science,2007,315(5819):1709-1712.DOI:10.1126/science.1138140.

[29] 李輝,施振旦.Cas9 新型基因打靶系統的研究進展[J].江蘇農業學報,2013,29(4):907-911.DOI:10.3969/j.issn.1000-4440.2013.04.037.

LI Hui,SHI Zhendan.Reaserch progress of gene targeting technology of CRISPR/Cas9 system[J].Jiangsu Journal of Agricultural Science,2013,29(4):907-911.DOI:10.3969/j.issn.1000-4440.2013.04.037.

[30] JARMAN A P,GRAU Y,JAN L Y,et al.Atonal is a proneural gene that directs chordotonal organ formation in the Drosophila peripheral nervous system[J].Cell,1993,73(7):1307-1321.DOI:10.1016/0092-8674(93)90358-W.

[31] WEI Y Z,CHESNE M T,TERNS R M,et al.Sequences spanning the leader-repeat junction mediate CRISPR adaptation to phageinStreptococcusthermophilus[J].Nucleic Acids Research,2015,43(3):1749-1758.DOI:10.1093/nar/gku1407.

[32] BARRANGOU R,MARRAFFINI L A.CRISPR-Cas systems:prokaryotes upgrade to adaptive immunity[J].Molecular Cell,2014,54(2):234-244.DOI:10.1016/j.molcel.2014.03.011.

[33] CHARPENTIER E,MARRAFFINI L A.Harnessing CRISPR-Cas9 immunity for genetic engineering[J].Current Opinion in Microbiology,2014,19:114-119.DOI:10.1016/j.mib.2014.07.001.

[34] MAKAROVA K S,HAFT D H,BARRANGOU R,et al.Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems[J].Nature Reviews Microbiology,2011,9(6):467-477.DOI:10.1038/nrmicro2577.

[35] ZHOU H B,LIU B,WEEKS D P,et al.Large chromosomal deletions and heritable small genetic changes induced by CRISPR/Cas9 in rice[J].Nucleic Acids Research,2014,42(17):10903-10914.DOI:10.1093/nar/gku806.

[36] KANCHISWAMY C N,SARGENT D J,VELASCO R,et al.Looking forward to genetically edited fruit crops[J].Trends in Biotechnology,2014,33(2):62-64.DOI:http://dx.doi.org/10.1016/j.tibtech.2014.07.003.

[37] BASSETT A R,LIU J L.CRISPR/Cas9 and genome editing inDrosophila[J].Journal of Genetics and Genomics,2014,41(1):7-19.DOI:10.1016/j.jgg.2013.12.004.

[38] ANDERS C,NIEWOEHNER O,DUERST A,et al.Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease[J].Nature,2014,513(7519):569-573.DOI:10.1038/nature13579.

[39] OH J-H,VAN PIJKEREN J-P.CRISPR-Cas9-assisted recombineering inLactobacillusreuteri[J].Nucleic Acids Research,2014,42(17):1-11.DOI:10.1093/nar/gku623.

[40] 劉瑩,鄭鵬生,張忠明.CRISPR系統結構及功能的研究[J].醫學分子生物學雜志,2014,11(4):297-302.DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2014.04.012.

LIU Ying,ZHENG Pengsheng,ZHANG Zhongming.Structure and function of CRISPR system[J].Journal of Medical Molecular Biology,2014,11(4):297-302.DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2014.04.012.

[41] DELTCHEVA E,CHYLINSKI K,SHARMA C M,et al.CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III[J].Nature,2011,471(7340):602-607.DOI:10.1038/nature09886.

[42] MALI P,ESVELT K M,CHURCH G M.Cas9 as a versatile tool for engineering biology[J].Nature Methods,2013,10(10):957-963.DOI:10.1038/NMETH.2649.

[43] 顏雯,李海濤,向華,等.CRISPR-Cas基因組改造技術研究進展[J].廣東農業科學,2014,2:149-152.

YAN Wen,LI Haitao,XIANG Hua,et al.Research progress on the genome modification technologies of CRISPR-Cas[J].Guangdong Agricultural Sciences,2014,2:149-152.

[44] JINEK M,CHYLINSKI K,FONFARA I,et al.A programmable dual-RNA-guided DNA ndonuclease in adaptive bacterial immunity[J].Science,2012,337(6096):816-821.DOI:10.1126/Science.1225829.

[45] ZHAO P,ZHANG Z,KE H M,et al.Oligonucleotide-based targeted gene editing in C.elegans via the CRISPR/Cas9 system[J].Cell Research,2014,24(2):247-250.DOI:10.1038/cr.2014.9.

[46] PORT F,CHEN H M,LEE T,et al.Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering inDrosophila[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2014,111(29):E2967-E2976.DOI:10.1073/pnas.1405500111.

[47] DAIMON T,KIUCHI T,TAKASU Y.Recent progress in genome engineering techniques in the silkworm,Bombyxmori[J].Development,Growth & Differentiation,2014,56(1):14-25.DOI:10.1111/dgd.12096.

[48] WANG J B,QUAKE S R.RNA-guided endonuclease provides a therapeutic strategy to cure latent herpesviridae infection[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2014,111(36):13157-13162.DOI/10.1073/pnas.1410785111.

[49] XIE F,YE L,CHANG J C,et al.Seamless gene correction of β-thalassemia mutations in patient-specific iPSCs using CRISPR/Cas9 andpiggyBac[J].Genome Research,2014,24(9):1526-1533.DOI:10.1101/gr.173427.114.

[50] HRUSCHA A,KRAWITZ P,RECHENBERG A,et al.Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish[J].Development,2013,140(24):4982-4987.DOI:10.1242/dev.099085.

[51] AIDA T,IMAHASHI R,TANAKA K.Translating human genetics into mouse:the impact of ultra-rapid in vivo genome editing[J].Development Growth Differentiation,2014,56(1):34-45.DOI:10.1111/dgd.12101.

[52] KABADI A M,OUSTEROUT D G,HILTON I B,et al.Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector[J].Nucleic Acids Research,2014,42(19):e147.DOI:10.1093/nar/gku749.

[53] CONG L,RAN F A,COX D,et al.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J].Science,2013,339(6121):819-823.DOI:10.1126/science.1231143.

[54] MALI P,YANG L H,ESVELT K M,et al.RNA-guided human genome engineering via Cas9[J].Science,2013,339(6121):823-826.DOI:10.1126/science.1232033.

[55] SUGANO S S,SHIRAKAWA M,TAKAGI J,et al.CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in the liverwortMarchantiapolymorphaL.[J].Plant and Cell Physiology,2014,55(3):475-481.DOI:10.1093/pcp/pcu014.

[56] FENG Z Y,ZHANG B T,DING W N,et al.Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system[J].Cell Research,2013,23(10):1229-1232.DOI:10.1038/cr.2013.114.

[57] ZHANG H,ZHANG J S,WEI P L,et al.The CRISPR/Cas9 system produces specific and homozygous targeted gene editing in rice in one generation[J].Plant Biotechnology Journal,2014,12(6):797-807.DOI:10.1111/pbi.12200.

[58] LI D L,QIU Z W,SHAO Y J,et al.Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system[J].Nature Biotechnology,2013,31(8):681-683.DOI:10.1038/nbt.2661.

[59] YOSHIMI K,KANEKO T,VOIGT B,et al.Allele-specific genome editing and correction of disease-associated phenotypes in rats using the CRISPR-Cas platform[J].Nature Communications,2014,5:4240.DOI:10.1038/ncomms5240.

[60] RAMAKRISHNA S,KWAKU DAD A-B,BELOOR J,et al.Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA[J].Genome Research,2014,24(6):1020-1027.DOI:10.1101/gr.171264.113.

[61] ZHANG C,XIAO B,JIANG Y Y,et al.Efficient editing of malaria parasite genome using the CRISPR/Cas9 system[J].mBio,2014,5(4):e01414-01414.DOI:10.1128/mBio.01414-14.

[62] ZHANG F,WEN Y,GUO X.CRISPR/Cas9 for genome editing:progress,implications and challenges[J].Human Molecular Genetics,2014,23(R1):R40-R46.DOI:10.1093/hmg/ddu125.

[63] TERNS R M,TERNS M P.CRISPR-based technologies:prokaryotic defense weapons repurposed[J].Trends in Genetics,2014,30(3):111-118.DOI:10.1016/j.tig.2014.01.003.

[64] LARSON M H,GILBERT L A,WANG X W,et al.CRISPR interference(CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression[J].Nature Protocols,2013,8(11):2180-2196.DOI:10.1038/nprot.2013.132.

[65] GILBERT L A,LARSON M H,MORSUT L,et al.CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes[J].Cell,2013,154(2):442-451.DOI:http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2013.06.044.

[66] FENG Y,SASSI S,SHEN J K,et al.Targeting CDK11 in osteosarcoma cells using the CRISPR-Cas9 system[J].Journal of Orthopaedic Research,2015,33(2):199-207.DOI:10.1002/jor.22745.

[67] 羅斌.CRISPR/Cas9技術介導的穩定沉默LDHA表達對肺癌A549細胞增殖的影響[J].生物技術世界,2015(1):97-98.

[68] HSU P D,SCOTT D A,WEINSTEIN J A,et al.DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases[J].Nature Biotechnology,2013,31(9):827-832.DOI:10.1038/nbt.2647.

[69] XIAO A,CHENG Z C,KONG L,et al.CasOT:a genome-wide Cas9/gRNA off-target searching tool[J].Bioinformatics,2014,30(8):1180-1182.DOI:10.1093/bioinformatics/btt764.

[70] GAO Y B,ZHAO Y D.Self-processing of ribozyme-flanked RNAs into guide RNAs in vitro and in vivo for CRISPR-mediated genome editing[J].Journal of Integrative Plant Biology,2014,56(4):343-349.DOI:10.1111/jipb.12152.

[71] HEIGWER F,KERR G,BOUTROS M.E-CRISP:fast CRISPR target site identification[J].Nature Methods,2014,11(2):122-123.DOI:10.1038/nmeth.2812.

[72] WAGNER J C,PLATT R J,GOLDFLESS S J,et al.Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum[J].Nature Methods,2014,11(9):915-918.DOI:10.1038/NMETH.3063.

[73] JIANG W Y,BIKARD D,COX D,et al.RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems[J].Nature Biotechnology,2013,31(3):233-239.DOI:10.1038/nbt.2508.

[74] DE SOUZA N.Genetics:more specific CRISPR editing[J].Nature Methods,2014,11(7):712-712.DOI:10.1038/nbt.2916.

[75] GUELL M,YANG L H,CHURCH G.Genome editing assessment using CRISPR genome analyzer(CRISPR-GA)[J].Bioinformatics,2014,30(2):2968-2970.DOI:10.1093/bioinformatics/btu427.

(責任編輯：趙藏賞)

Research status of novel gene editing technology of CRISPR/Cas9 system

QIAN Leiyang,ZHOU Zhijun,CHANG Yanlin

(Key Laboratory of Invertebrate Systematics and Application of Hebei Province,College of Life Sciences,Hebei University,Baoding 071002,China)

Abstract：Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR) and associated proteins(Cas) comprise the CRISPR/Cas system,which confers adaptive immunity against foreign invading phages,plasmids and other mobile elements in many bacteria and most archaea.On the basis of the species and homology of the Cas protein,CRISPR/Cas systems have been classified into three distinct groups(type Ⅰ～Ⅲ).The component of type Ⅱ CRISPR/Cas9 system is the simplest one,and is well-charactered in resent study.CRISPR/Cas9 system modified by genetic engineering has proven to be an efficient gene-targeting tool in various organisms.Here,the auther review the discovery,components,molecular mechanism,applications,challenges and future prospect of CRISPR/Cas9-mediated genome editing.

Key words:gene editing;CRISPR/Cas9;CRISPRi;interference mechanism;gene therapy

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2016.01.014

收稿日期：2015-07-02

基金項目：國家自然科學基金面上項目(31471985);河北省高等學校青年拔尖人才計劃項目(BJ2014006)

通信作者：周志軍(1980—),男,山西長治人,河北大學副教授,博士,主要從事昆蟲分子系統進化研究.

中圖分類號：Q789

文獻標志碼：A

文章編號：1000-1565(2016)01-0084-10

第一作者：騫蕾陽(1990—),女,河北武安人,河北大學在讀碩士研究生. E-mail:qianleiyanghb@163.com

E-mail:zhijunzhou@163.com