肝癌患者與健康人外周血Vγ9Vδ2T細胞擴增前后比例及分化亞型對比

馬 俊 趙浩亮 田 偉 賀杰峰 李高鵬

肝癌患者與健康人外周血Vγ9Vδ2T細胞擴增前后比例及分化亞型對比

馬 俊 趙浩亮 田 偉 賀杰峰 李高鵬

目的 探討肝細胞癌（HCC）患者外周血的Vγ9Vδ2T細胞比例，成熟分化亞型與健康人的差別，經體外擴增后上述指標的變化。方法 選取健康捐獻者（n=10）和HCC患者（n=20）的外周血共10mL，采用不連續密度梯度離心法分離單核細胞層，借助流式細胞術檢測Vγ9Vδ2T細胞占總T細胞比例，成熟分化亞型，并在體外加入唑來膦酸和IL-2進行擴增培養，12～14d后收集細胞再次檢測上述指標。結果 培養前HCC組患者外周血中Vγ9Vδ2T細胞占總T細胞比例的平均值比健康人低（P<0.05，P=0.009），在經過體外擴增培養后其比例明顯升高（P<0.0001），而在體外擴增后患者與健康人的Vγ9Vδ2T細胞比例差異無統計學意義（P＞0.05，P=0.3408）。患者Vγ9Vδ2T細胞的分化與成熟亞型作體外培養的前后對比發現，培養后Tn、Tcm、Temra的比例較培養前有明顯下降（P<0.05，P=0.0045，P=0.0236，P=0.0162）；患者和健康人Tem比值均較培養前明顯升高（P<0.0001）；而在擴增前、擴增后患者和健康人的Vγ9Vδ2T細胞的成熟分化比例差異均無統計學意義。結論 肝癌患者外周血Vγ9 Vδ2T細胞比例雖然低于健康人，但其分化成熟亞型的分布比例與健康人相似，且經過體外擴增培養后Vγ9Vδ2T細胞和總效應細胞比例，均與健康人無差異。其增殖功能得到恢復，肝癌患者和健康人中應用這種體外擴增方法外周血Vγ9Vδ2T細胞的效果相似。

肝細胞癌；Vγ9Vδ2T細胞；過繼免疫治療；唑來膦酸

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是消化系統最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和病死率均居前列[1]，雖然已逐步形成外科手術、局部消融治療，放化療、經肝動脈或門靜脈灌注化療等綜合治療模式，但是肝癌轉移、復發問題仍未完全解決。隨著分子免疫和生物學的發展，生物免疫治療日益受到關注，尤其是以γδT細胞為基礎的過繼性細胞治療免疫應用在肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、黑色素瘤、結直腸癌、腎癌、乳腺癌等多種實體腫瘤的細胞和臨床實驗中取得具有顯著療效而成為研究熱點[2]。

γδT細胞根據δ鏈的亞型可分為Vδ1 T細胞和以Vγ9Vδ2T細胞為主的Vδ2 T細胞。其中Vδ2 T細胞主要參與人體免疫反應和防御功能。據對細胞表面標志物和細胞因子刺激而發生增殖和分化的功能不同，Vγ9Vδ2T細胞又可分為幼稚型(Tn，CD45RA(+)CD27(+))、中心記憶型[Tcm，CD45RA(-)CD27(+)]、效應記憶型[Tem，CD45RA(-) CD27(-)]和終末分化型[Temra，CD45RA(+)CD27(-)]4型。其中Tem和Temra主要分布于感染及腫瘤組織部位，在人體內抗感染和抗腫瘤免疫方面起主要作用[3]，稱之為總效應型。而γδT細胞總效應型的變化必然影響到其免疫功能的狀態。研究發現，肝癌患者體內持續存在嚴重的免疫抑制現象[4]，這種免疫抑制狀態是否和到γδT細胞有相關，進而導致肝癌的發展和轉移，我們不得而知，所以本研究旨在將肝癌患者外周血的Vγ9Vδ2T細胞比例、分化亞型與健康人對比和分析，以期初步了解肝癌患者體內的某些免疫狀態。并在體外使用唑來膦酸加IL-2擴增γδT細胞[5]，并與健康人對比分析，了解肝癌患者外周血γδT細胞增殖能力和增殖后細胞亞型，為進一步研究提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 HCC患者（n=20）和健康捐獻者（n=10）在被告知知情同意書后登記入名單，患者納入標準為經病理診斷或臨床診斷標準（原發性肝癌診療規范(2011年版)，中華人民共和國衛生部）[6]確診的原發性肝癌患者，無全身免疫疾病，既往無全身化療史。材料：Ficoll分離液，美國GE Healthcare公司；GT-T551淋巴細胞培養基，日本TaKaRa公司；0.4% Trypan Blue Stain，美國Life Technologies公司；無菌PBS，武漢博士德生物工程有限公司；CD3-PC5，美國eBioscience公司；TCR-Vγ9-PE，CD45RA-FITC，CD27-PC7，美國BD Biosciences公司；TCR-γδ-FITC，美國Beckman Coulter公司；唑來膦酸，瑞士諾華制藥有限公司；IL-2，北京四環生物制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Vγ9Vδ2T細胞的分離 清晨取健康志愿者和HCC患者的外周血2份，每份5mL，3000轉/min(RPM)離心5min，用等量生理鹽水稀釋后，輕輕加于(Ficoll)淋巴細胞分離液(5mL)上，2000r/min離心20min，取中間層細胞，生理鹽水洗2遍后，計細胞數。

1.2.2 Vγ9Vδ2T細胞與分化表型鑒定 收集分離出的淋巴細胞，調整細胞濃度為1×106/mL，每個樣本取100μL個2份，按抗體說明書于第1管加入CD3-PC5抗體，TCRVγ9-PE抗體，TCR-γδ-FITC抗體；于第2管加入CD3-PC5抗體，CD45RA-FITC抗體，CD27-PC7抗體，4℃避光孵育20～30min，PBS洗2次，用PBS 500μL重懸細胞，流式細胞儀檢測分析。

1.2.3 Vγ9Vδ2T細胞體外培養 在山西省腫瘤醫院的特定GMP級實驗室的藥品生產質量管理規范條件下進行細胞制備和培養，用GT-T551淋巴細胞培養基（添加滅活的自體血清，慶大霉素）進行培養，37℃，5% CO2培養箱中培養。培養第1天加入唑來膦酸5μmol/L和人重組IL-2 1000IU/mL，每2～3天觀察細胞增殖情況，根據細胞培養情況加入10mL新鮮培養基（含人重組IL-2 1000IU/mL），培養12～14d收獲γδT細胞。

1.2.4 培養后Vγ9Vδ2T細胞的鑒定和亞型檢測 收集培養的細胞，調整細胞濃度為1×106/mL，再次采用流式細胞儀進行Vγ9Vδ2T細胞與分化表型鑒定，方法同前。

1.3 統計學方法 采用SPSS15.0統計軟件進行統計分析，計量資料采用“x±s”表示，配對樣本間比較采用配對t檢驗方法，非配對樣本間比較采用非配對t檢驗方法，P<0.05（雙尾）為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 在整個培養過程中，健康人組10例全部培養成功，無細胞污染。患者組20例有2例經過培養后細胞無擴增，未能收獲細胞。HCC患者外周血中Vγ9Vδ2T細胞占總T細胞比例的平均值在培養前比健康人低（P<0.05），在經過體外藥物擴增培養后其比例明顯升高（P<0.05），與健康人相比差異無統計學意義。見圖1A、圖2。

2.2 Vγ9Vδ2T細胞成熟分化亞型分析 培養前測定患者外周血中Tn、Temra、Tcm、Tem的比例與健康人相比差異無統計學意義。見圖1B。在經過體外藥物擴增培養后與健康人相比，患者Vγ9Vδ2T細胞成熟分化亞型Tn、Temra、Tcm、 Tem的比例差異無統計學意義。見圖1C。即在擴增前、后患者和健康人2組之間的Vγ9Vδ2T細胞的成熟分化比例差異均無統計學意義。而患者的Vγ9Vδ2T細胞的分化亞型體外擴增前、后對比發現。見圖1D。Tn的比例在培養后較培養前有明顯下降（P<0.05），Tcm比例在培養后較培養前下降（P<0.05），患者和健康人的Tem比值均較培養前明顯升高（P<0.05），患者和健康人的Temra比例均較培養前下降（P<0.05），總效應型較擴增前明顯升高（P<0.05）。見表1。

圖1 A 肝癌患者與健康人擴增前、后Vγ9Vδ2T細胞/總T細胞比例；圖1B 肝癌患者與健康人擴增前Vγ9Vδ2T細胞成熟分化亞型比例；圖1C肝癌患者與健康人擴增后Vγ9Vδ2T細胞成熟分化亞型比例；圖1D 肝癌患者擴增前、后Vγ9Vδ2T細胞成熟分化亞型比例(x×s，P＜0.05)

圖2 Vγ9Vδ2T細胞擴增前后典型流式細胞圖

3 討論

腫瘤的發展不是獨立事件，其中免疫逃逸與免疫抑制對腫瘤的發展具有十分重要的作用。我們發現在先天或獲得性免疫缺陷的患者中誘發或自發腫瘤的發生率明顯高于健康人，這個證據證明當機體的免疫監視和防御功能被抑制或低下時，可能發生患者體內局部腫瘤細胞的免疫逃逸[7]。肝癌是一種免疫原性弱的腫瘤，其腫瘤細胞具有免疫逃避和對機體免疫系統的抑制作用，機體自身的免疫系統和免疫細胞會受到抑制和忽視腫瘤細胞，所以直接輸入具有直接特異免疫力的過繼性細胞治療可以避免患者機體內的免疫抑制環境，而起到直接殺傷腫瘤細胞的作用，而且其可以與手術、化療、區域灌注化療、免疫調節劑等聯合或輔助使用，具有廣闊的前景[8]。

表1 肝癌患者與健康人擴增前后Vγ9Vδ2T細胞/總T細胞比例，Vγ9Vδ2T細胞成熟分化亞型比例（x±s，%）

研究證實，磷酸抗原激活Vγ9Vδ2T細胞是目前γδ T細胞為基礎的抗腫瘤研究最常用方法[9]。Nicol AJ等[5]發現健康捐獻者的Vγ9Vδ2T細胞在體外培養時同時使用唑來膦酸加上IL-2時會大量擴增，但是對來自惡性腫瘤患者的Vγ9 Vδ2T細胞在體外擴增其擴增的倍數和擴增比例是有差異的，他們將患有各種不同腫瘤如肺癌、腎癌、黑色素癌甚至轉移癌等患者按臨床效果評價體系分成高反應和低反應組，發現低反應組在擴增前后Vγ9Vδ2T細胞的比例、倍數與健康人和高反應組相比明顯降低。而在擴增前分化與成熟亞型對比上是有差異的，其Tn和Temra明顯高于健康人和高反應組，并且提示其差異與Vγ9Vδ2T細胞擴增結果有相關性，而高反應組在擴增前成熟分化亞型的比例分布和擴增能力與健康人無差異，證明部分腫瘤患者體內Vγ9Vδ2T細胞數量，亞型及功能與健康人一致。本研究采用相同的擴增方法，結果提示肝癌患者外周血Vγ9Vδ2T細胞占總T細胞的比例比健康人低，提示肝癌患者體內可能存在免疫抑制，而在培養后細胞比例與健康人無差異，提示Vγ9Vδ2T細胞在體外脫離免疫抑制后，其擴增能力得以恢復。肝癌患者外周血Vγ9Vδ2T細胞成熟分化比例在培養前與健康人相比差異無統計學意義，而在培養前后患者和健康人的Vγ9Vδ2T細胞的成熟分化比例同樣差異均無統計學意義，說明患者Vγ9Vδ2T細胞各分化亞型的擴增能力與健康人無差異，而擴增前后對比發現Tem顯著升高，Temra下降，而Tem和Temra之和，即總效應型是升高的，且患者與健康人培養后比值無差異，說明肝癌患者外周血Vγ9Vδ2T細胞經過體外培養后在殺傷腫瘤細胞的效應細胞比值增加趨勢和程度與健康人一致，所以從具有殺傷腫瘤細胞功能的有效細胞比例上能夠在擴增后與健康人達到相同的效果，上述結果與證明肝癌患者外周血中Vγ9Vδ2T細胞在脫離體內免疫環境后經體外使用唑來磷酸鈉和IL-2后其增殖能力得以恢復，其分化成熟亞型和比例與健康人無差異，這與NicolAJ等結果一致。

研究表明，肝癌患者外周血Vγ9Vδ2T細胞雖然在低于正常人的比例，但其分化成熟亞型與健康人相似，且經過體外擴增培養后，其比例分布趨勢與健康人無差異，說明繁殖功能得到恢復，所以本文初步說明HCC患者進行體外Vγ9Vδ2T細胞是可行的，為未來過繼免疫治療的免疫細胞來源提供一定依據，當然，培養后的細胞能否殺傷特異的肝癌腫瘤細胞，還需要做細胞共培養殺傷實驗以及動物實驗。另外外周T細胞的亞型很多，除了起到免疫防御的免疫識別和效應細胞外，還有好多其他功能的細胞，比如具有免疫抑制作用的等調節性T細胞(Treg細胞)[10]等，作為存在于外周血中的重要的免疫抑制細胞，其在肝癌患者體內的比例與健康人是否有差異，以及經體外擴增后Treg細胞是否也隨之大量擴增從而起到更為嚴重的免疫抑制作用，這些情況我們均不清楚，還需要進一步研究。

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Objective To pride the difference of percentage, mature classifi cation of Vγ9Vδ2T cell in peripheral blood between patients with HCC and healthy people, the index changes after amplifi cation in vitro. Methods 10 mL were taken from the peripheral blood of HCC patients (n= 20) and healthy donors (n=10), Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated by the discontinuous density gradient centrifugation. The delta 2 T cells mature and differentiate subtypes of Vγ9Vδ2Tcells were detect by using flow cytometry, Vγ9Vδ2Tcell were selectively cultured with zoledronate and human IL - 2, after 12-14 days cells were collected and tested the above indicators again. Results The average percentage ofVγ9Vδ2Tcell of total T cell in peripheral blood of HCC patients is lower than healthy people in front of the train (P<0.05, P=0.009), after in vitro augmentation training with drugs the proportion increased signifi cantly (P<0.0001).While Vγ9Vδ2Tcell’s percentage of patients and healthy people have no difference after amplification in vitro (P>0.05, P=0.3408). When differentiation and mature subtypes of Patient’s Vγ9Vδ2Tcell were compared between before and after culturing in vitro, we can found that the proportion of Tn, Tcm,Temra before training were signifi cantly lower than after the training (P<0.05, P=0.0045, P=0.0236, P=0.0162); and proportion of Tem before training were higher than after the training (P<0.0001). While differentiation proportion of mature t cells of the patients and healthy people had no statistical difference comparing amplifi cation of before with after. Conclusion While the percentage of Vγ9Vδ2Tcell of HCC patients in peripheral blood was lower than healthy people, but its matured subtypes are similar to those of healthy people. After amplifi cation in vitro the ratio of Vγ9Vδ2Tcells and total effective cells have no difference with healthy people. Its Function of amplifi cation can also restore. When applying this method to amplify Vγ9Vδ2Tcells of peripheral blood in vitro its effect is similar in HCC patients and healthy people.

Hepatocellular carcinoma;Vγ9Vδ2T; Adoptive cellular immunotherapy; Zoledronate

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.7.001

山西省科技攻關項目（130313021-17） 國家自然青年科學基金（81201810） 廣東省自然科學基金面上項目（2015A030313057)

山西 030032 山西醫科大學附屬山西大醫院 （馬俊） 山西醫科大學附屬山西大醫院普外科 （趙浩亮 田偉 賀杰峰） 山西醫科大學第二醫院（李高鵬）

趙浩亮 E-mail:haoliangzhao@hotmail.com