一株產酯酶菌的分離鑒定及其酶學性質研究

段　俐，趙　一，王崇慧，王麗麗

(河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018)

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一株產酯酶菌的分離鑒定及其酶學性質研究

段俐，趙一，王崇慧，王麗麗

(河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018)

摘要：從土壤中分離得到一株產酯酶菌，經16S rDNA 序列測定，屬于嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，命名為S.mal SF-H。對該菌株產酶的誘導效應及其酶學性質進行了研究。結果表明，培養基中加入5 g·L-1檸檬酸三正丁酯塑化劑，可以有效誘導該菌株產生酯酶，所產酯酶對短鏈脂肪酸酯的水解活性有明顯底物特異性和差異性。以對硝基苯乙酸酯為底物時，酶液表現出良好的耐溫性，最適溫度為80 ℃，且70 ℃保溫2 h的相對酶活力為95%，最適pH值為9.0，在pH值為8.0時穩定性最好；以對硝基苯丁酸酯為底物時，酶的最適溫度為70 ℃，70 ℃保溫2 h的相對酶活力為51%，最適pH值為8.0，在pH值為8.0～10.0時穩定性最好。所產酯酶的耐溶劑性表現基本一致，在66%丁醇和66%乙醇中相對酶活力均約為60%。

關鍵詞：酯酶；檸檬酸三正丁酯；16S rDNA；嗜麥芽寡養單胞菌

酯酶(esterase，EC3.1.1.1)是一類特異水解短鏈脂肪酸酯的水解酶類，廣泛存在于動物、 植物和微生物中。研究發現，酯酶可以在有機相中完成酯化、轉酯、酯交換等多種反應[1]，特別是可專一性地制備許多化學法難以合成的手性化合物和聚合物[2-3]。閻家麒[4]采用牛肝酯酶催化了紫杉醇側鏈的手性合成。王博[5]篩選得到了一種高活性和高選擇性的水解酶(酯酶Escherichia coliBioH)，該酶對仲醇類化合物具有非常好的手性選擇性，在水溶液中可以將一系列仲醇乙酸酯較好地拆分，ee值最高可達98%。鞠鑫[6]篩選得到了一株以高活力和高對映選擇性催化S-乙酰基扁桃酸水解的假單胞菌Pseudomonassp.ECU1011，其能以乙酰基扁桃酸及扁桃酸甲酯和乙酯為目標底物酶促水解生成手性扁桃酸。Li等[7-8]從古生物球菌中提取了一種嗜熱酯酶，在甲苯溶液中于70 ℃催化ε-己內酯開環聚合反應，反應24h時產率達到99%。與化學法相比，酯酶催化反應的條件溫和，可避免使用有毒催化劑。

塑化劑，也稱增塑劑，是在塑料加工中添加的一種高分子助劑，以增強塑料的柔韌性和可加工性。目前，塑化劑的生產都是通過化學法完成的，探索酶法合成檸檬酸酯類塑化劑的途徑，是綠色生物技術的研究方向之一。由于酯酶具有水相分解、有機相催化合成的功效，因此，作者在此篩選能夠水解檸檬酸酯類塑化劑的酯酶，并對其進行鑒定和酶學性質研究。

1實驗

1.1材料、試劑與培養基

土壤樣本，取自多地。

對硝基苯乙酸酯、對硝基苯丁酸酯、對硝基苯辛酸酯、對硝基苯月桂酸酯、對硝基苯棕櫚酸酯，北京百靈威科技有限公司；塑化劑檸檬酸三正丁酯(LM30)，江蘇雷蒙化工科技有限公司。

ZM-CD液體基礎培養基(1L)：(NH4)2SO44g、KH2PO41g、MgSO4·7H2O1g、NaCl0.5g、Fe2+1mg、Zn2+1mg、Mn2+0.5mg、Cu2+0.5mg，調pH=7.0，121 ℃下高溫滅菌，無菌GF(1mL/400mL)。

篩選固體培養基(1L)：ZM-CD液體基礎培養基中加入瓊脂22g及LM30 10g。

富集液體培養基(1L)：ZM-CD液體基礎培養基中加入LM30 10g及溴甲酚紫0.04g(變色pH值范圍：5.2～6.8，黃色～紫色)，pH=7.0。

發酵液體培養基(1L)：ZM-CD液體基礎培養基中加入不同濃度的蛋白胨、酵母粉、碳源、LM30等。

1.2方法

1.2.1菌株的富集與篩選

將100份土壤樣品稀釋后，分別涂布到篩選固體培養基平板上，30 ℃下培養3d；挑取生長良好的菌落，分別接種到50mL/250mL富集液體培養基中，30 ℃、180r·min-1下培養3d，淘汰溴甲酚紫不變色的搖瓶，保留變成黃色的搖瓶；10%接種，轉接到新的富集液體培養基中，連續富集培養5代。每一代均保留變色時間短、生長快的搖瓶，將最后一代富集液梯度稀釋分離，得到純化優勢菌株。

1.2.2菌株的鑒定

擴增菌株后，進行16SrDNA的PCR擴增及序列分析，測序結果在NCBI數據庫中進行Blastn搜索[9]，獲得與其同源性相近的序列，再使用MEGA6.0 軟件構建系統發育進化樹。

1.2.3酯酶酶活力的測定

菌株液體培養30h后，于6 500r·min-1下離心10min，取上清液作為粗酶液，參照文獻[10-11]方法測定酯酶酶活力。

酶活力單位：每分鐘釋放出1μmol對硝基苯酚所需要的酶量定義為一個酶活力單位。

相對酶活力：處理樣品的酶活力與最大酶活力的百分比。

1.2.4酶液的濃縮及SDS-PAGE凝膠電泳

使用10kDa的截止離心膜過濾器(Millipore公司，美國)對上清液進行超濾濃縮[12]，12mL粗酶液在5 000g、4 ℃的條件下離心40min，得到200μL的粗酶濃縮液。將所得粗酶濃縮液處理后進行SDS-PAGE凝膠電泳。

1.2.5酶學性質分析

以粗酶液為檢測對象，測定反應溫度、pH值、有機溶劑等對酶活力的影響。

2結果與討論

2.1菌株的篩選及鑒定

培養基以塑化劑LM30作為唯一碳源，若胞外酯酶分解LM30，會使檸檬酸的羧基游離，溶液pH值下降，酶活力提高，分解速度加快，當培養基pH值下降到5.2以下時會由紫色變成黃色。因此，對變色最快的菌株進行多輪富集培養，再稀釋分離純化，并經液體培養基分別培養3 d后，測定酯酶酶活力，篩選出酶活力較高的菌株，作進一步的鑒定[13-14]，并將其命名為SF-H。

菌株SF-H在固體培養基上于30 ℃下培養24 h后，菌落呈灰黃色，圓形，表面較黏稠而濕潤，不透明，邊緣整齊。顯微鏡下個體形態為桿狀，革蘭氏染色為陰性。

對菌株SF-H進行16S rDNA的PCR擴增、序列分析，結果表明，該菌株與嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)16S rDNA的一致性為99%，鑒定為嗜麥芽寡養單胞菌SF-H(StenotrophomonasmaltophiliaSF-H，縮寫為S.malSF-H)，利用MEGA 6.0軟件構建系統發育進化樹，如圖1所示。

圖1　菌株S.mal SF-H與Stenotrophomonas maltophilia屬內各菌種間基于16S rDNA序列的系統發育分析

2.2S.mal SF-H菌株生長與酯酶產生關系的研究

菌株S.malSF-H在液體培養基中培養48 h，每隔6 h取樣測定其在600 nm下的吸光度(OD600值)及上清液酶活力，以菌株生長和相對酶活力(以最高值為100%)對時間作圖得到S.malSF-H菌株生長曲線和酯酶產生曲線，如圖2所示。

圖2　S.mal SF-H菌株生長曲線與酯酶產生曲線

由圖2可知，菌株在12 h時達到最大菌體量，18 h后菌體量開始逐漸減少；在0～30 h時，相對酶活力逐漸增大，30 h時達到最大值，超過30 h后，相對酶活力逐漸降低。因此，發酵周期定為30 h。

2.3塑化劑LM30對產酶的誘導效應

將菌株S.malSF-H分別在含有和不含有塑化劑LM30的發酵培養基(含麥芽糖、酵母粉、蛋白胨3種有機物)中培養30 h后，離心獲得上清液，分別超濾濃縮60倍后，進行SDS-PAGE凝膠電泳，結果如圖3所示。

M.上樣Marker　1.空白培養基　2.未加

由圖3可知，加入LM30后胞外蛋白產物明顯增多，特別是分子量大小在20 kDa左右的兩條蛋白帶。NCBI數據庫的基因組信息顯示，Stenotrophomonasmaltophilia含有6個酯酶基因，其中有2個基因產物的分子量大小都在20 kDa左右，可推測圖3中20 kDa的蛋白帶為酯酶的2個基因表達產物，表明LM30有明顯的產酯酶誘導作用。

2.4S.mal SF-H菌株所產酯酶的酶學性質研究

2.4.1酯酶的底物特異性

用0.05 mol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH=8.0)分別配制5種底物溶液：對硝基苯乙酸酯(pNPC2)、對硝基苯丁酸酯(pNPC4)、對硝基苯辛酸酯(pNPC8)、對硝基苯月桂酸酯(pNPC12)、對硝基苯棕櫚酸酯(pNPC16)。用等量酶液分別水解5種底物，在pH=8.0、37 ℃下水浴5 min后，測定產物對硝基苯酚的產量，進而比較酶活力大小，結果見圖4。

圖4　S.mal SF-H菌株所產酯酶的底物特異性

由圖4可知，對硝基苯乙酸酯作為底物的相對酶活力最大，對硝基苯丁酸酯作為底物的相對酶活力次之，其它3種底物的相對酶活力很小，有明確的底物特異性。表明，菌株S.malSF-H產生的胞外蛋白均為酯酶，而非脂肪酶。

2.4.2酯酶的最適反應溫度

分別以對硝基苯乙酸酯、對硝基苯丁酸酯為底物，測定不同反應溫度(30～80 ℃)下的相對酶活力(以最大值為100%)，結果見圖5。

由圖5可知，隨著反應溫度的升高，相對酶活力逐漸升高；當反應溫度為80 ℃時，以對硝基苯乙酸酯為底物的相對酶活力仍在升高，而以對硝基苯丁酸酯為底物的相對酶活力開始下降，但仍有92%。說明該酯酶有較高的溫度耐受性[15-16]，以對硝基苯乙酸酯為底物時，酶的最適溫度為80 ℃，以對硝基苯丁酸酯為底物時，酶的最適反應溫度為70 ℃。

2.4.3反應溫度對酯酶穩定性的影響

將酶液分別置于30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、 70 ℃和80 ℃的水浴中，反應2 h后恢復到37 ℃，分別測定以對硝基苯乙酸酯和對硝基苯丁酸酯為底物的相對酶活力(以4 ℃下保存的酶活力為最大值100%)，結果見圖6。

圖5　反應溫度對酯酶活力的影響

圖6　反應溫度對酯酶穩定性的影響

由圖6可知，在50 ℃下，以對硝基苯乙酸酯為底物的相對酶活力為96%，以對硝基苯丁酸酯為底物的相對酶活力為63%；在70 ℃下，以對硝基苯乙酸酯為底物的相對酶活力為95%，以對硝基苯丁酸酯為底物的相對酶活力為51%；在80 ℃下，以對硝基苯乙酸酯為底物的相對酶活力為85%，以對硝基苯丁酸酯為底物的相對酶活力為39%。該結果進一步表明，菌株S.malSF-H產生的酯酶的耐溫性對不同底物有明顯差別。

2.4.4酯酶的最適pH值

分別配制pH值為5.0～10.0的緩沖液(磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液pH值為5.0～8.0，硼砂-氫氧化鈉緩沖液pH值為9.0～10.0)[17]，測定不同pH值下的相對酶活力(以最大值為100%)，結果見圖7。

由圖7可知，當pH=9.0時，以對硝基苯乙酸酯為底物的相對酶活力最高為100%；當pH=8.0時，以對硝基苯丁酸酯為底物的相對酶活力最高為100%。表明，菌株S.malSF-H產生的酯酶以對硝基苯乙酸酯、對硝基苯丁酸酯為底物時的最適反應pH值分別為9.0、8.0。

2.4.5pH值對酶穩定性的影響

將酶液室溫下分別置于不同pH值(5.0～10.0)的緩沖液中作用2 h后，恢復到正常條件下測定相對酶活力(以最高值為100%)，結果見圖8。

圖7　pH值對酯酶活力的影響

圖8　pH值對酯酶穩定性的影響

由圖8可知，以對硝基苯乙酸酯為底物時，在pH=8.0時，相對酶活力最高為100%，穩定性最好，在pH值為9.0～10.0時，相對酶活力在75%以上，在pH<8.0之后相對酶活力明顯下降，在pH≤7.0之后，相對酶活力低于75%；在以對硝基苯丁酸酯為底物時，相對酶活力隨pH值的增大而升高，在pH=10.0時相對酶活力最高100%。說明該酯酶有較好的耐堿性，在堿性條件下酶活力更高[18-20]。

2.4.6酯酶對有機溶劑的耐受性

酶液分別與99%正丁醇、99%乙醇、50%乙醇以1∶2(體積比，下同)混合，混合后實際有機溶劑含量分別為66%正丁醇、66%乙醇、33%乙醇。穩定2 h后，在37 ℃水浴、pH=8.0的條件下測定相對酶活力(以酶液與水1∶2混合液作對照為100%)，結果見圖9。

由圖9可知，在加入有機溶劑后，2種底物的相對酶活力均明顯降低，在66%正丁醇、66%乙醇條件下，相對酶活力只有約60%，而且在有機溶劑中2種底物表現基本一致。但總的說來，該酯酶具有較強的有機溶劑耐受性。

3結論

從土壤中分離到一株酯酶產生菌，經16S rDNA序列測定，屬于嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，命名為S.malSF-H。該菌培養基中加入5 g·L-1塑化劑檸檬酸三正丁酯，可以有效誘導該菌株產生酯酶，SDS-PAGE凝膠電泳結果顯示，誘導后胞外酶蛋白明顯增多，且存在對短鏈脂肪酸酯的底物特異性和差異性。以對硝基苯乙酸酯為底物時，酶液表現出良好的耐溫性，最適溫度為80 ℃，且70 ℃保溫2 h的相對酶活力為95%，最適pH值為9.0，在pH值為8.0時穩定性最好；以對硝基苯丁酸酯為底物時，酶的最適溫度為70 ℃，70 ℃保溫2 h的相對酶活力為51%，最適pH值為8.0，在pH值為8.0～10.0時穩定性最好。所產酯酶在不同有機溶劑中的耐受性基本一致，在66%丁醇和66%乙醇中相對酶活力均約為60%。但總的說來，該菌產生的酯酶都有較高的耐溫性和耐有機溶劑性，為今后在檸檬酸酯類塑化劑合成的應用奠定了基礎。

圖9　酯酶對有機溶劑的耐受性

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Isolation and Identification of An Esterase-Producing Strainand Its Enzymatic Properties

DUAN Li,ZHAO Yi,WANG Chong-hui,WANG Li-li

(CollegeofBioscience&Bioengineering,HebeiUniversityofScienceandTechnology,Shijiazhuang050018,China)

Abstract：An esterase-producing strain was isolated from the soil.It was identified as Stenotrophomonas maltophilia by 16S rDNA sequence analysis and named as S.mal SF-H.The inductive effects of esterase producing and the enzymatic properties of the strain were studied.Results showed that adding 5 g·L-1tributyl citrate(TBC) to the medium could effectively induce the strain to produce esterases.The esterases had significant substrate specificity and diversity on hydrolytic activity among short-chain aliphatic esters.When using p-nitrophenyl acetate as a substrate,S.mal SF-H exhibited great temperature tolerance.The optimum temperature was 80 ℃,and the relative enzyme activity was 95% after water bath at 70 ℃ for 2 h,the optimum pH value was 9.0,and enzyme stability was the best at pH=8.0.When using p-nitrophenyl butyrate as a substrate,the optimum temperature was 70 ℃,and the relative enzyme activity was 51% after water bath at 70 ℃ for 2 h,the optimum pH value was 8.0,and enzyme stability was the best at pH=8.0～10.0.However,the solvent resistance for all esterases were similar,the relative enzyme activities were about 60% in 66% butanol or 66% ethanol solvents.

Keywords：esterase;tributyl citrate;16S rDNA;Stenotrophomonas maltophilia

基金項目：國家863計劃資助項目(2014AA022102)

收稿日期：2016-01-13

作者簡介：段俐(1990-)，女，河北石家莊人，碩士研究生，研究方向：工業微生物及其應用，E-mail:byzzywyfwz2426@163.com；通訊作者：王麗麗，教授，E-mail：88632wanglili@163.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.05.005

中圖分類號：Q 556

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)05-0020-06