必特螺旋霉素發酵組分中亮氨酸的影響研究

杜仙娥 付聯群 李紅梅

必特螺旋霉素發酵組分中亮氨酸的影響研究

杜仙娥 付聯群 李紅梅

目的 研究分析必特螺旋霉素發酵組分中亮氨酸的影響。方法 在合成培養基中加入亮氨酸，觀察其對于必特螺旋霉素發酵組分的影響。結果 加入亮氨酸以后，對于初級代謝所產生的影響不大，可提高異戊酞基螺旋霉素組分以及總異戊酰基螺旋含量，效價保持不變。討論 亮氨酸可使必特螺旋霉素主要組分作用機理得到提高。

亮氨酸；組分；效價；必特螺旋霉素

目前關于支鏈氨基酸代謝影響抗生素生物合成與相關酶方面的研究已非常多，曾有學者在avermectin生物合成研究中發現若突變菌株不含支鏈-2氧基脫氫酶活性，則不能在不含亮氨酸、纈氨酸以及異亮氨酸的合成培養基中正常生長[1]。經相關文獻報道研究發現，氨基酸與脂肪酸類物質對于鏈霉菌酞化抗生素產生具有誘導以及促進作用[2-3]。

1 材料與方法

1.1 一般材料 所用菌株為含有異戊酞基轉移酶基的整合型螺旋霉素鏈霉菌F21，根據要求配制斜面培養基、生物效應測定培養基、種子培養基以及發酵培養基。所用試劑有丁酸、乙酸、異戊酸、檸檬酸、琥珀酸、α-酮戊二酸以及丙酮酸，除α-酮戊二酸是生化試劑以外，其余均是分析純試劑，所用儀器有FUS-15L發酵罐，該儀器不僅配備常規測量控制，如溫度、DO、轉速和消泡等，還配備高精度補料測控，比如基質、消泡劑以及酸堿等。

1.2 方法 采取PMV法對菌種濃度進行測定。將10mL發酵液放在離心機進行離心，時間為10min左右。根據中國藥典采取杯碟法對生物效價進行測定，將乙酰螺旋霉素當作標準品，而鑒定菌則是枯草芽孢桿菌。采取HPLC法對有機酸以及氨基酸進行測定，主要如下：首先對樣品進行處理，將必特螺旋霉素發酵液放在離心機進行離心，時間共為10min，取上清液放在-20℃儲存備用。分析時取1mL，進行離心，而后用合成纖維素酯膜實施真空過濾。在測定有機酸時，α-酮戊二酸、乙酸、丙酮酸以及丙酸色譜柱為AquaSep，甲醇為98.4︰1.3，流動相為0.01mol/L磷酸水溶液，流速為每分鐘1mL，檢測器波長為210nm，且柱溫為30℃。測定異戊酸和丁酸時，色譜柱為Shimpack VP-ODS，甲醇為60︰40，流動相、流速條件均和乙酸等一致。在測定氨基酸時，所用色譜柱為AgilentDB-C18，柱溫為38℃，流速為每分鐘1mL，波長為254nm。借助于自動進樣器進樣，采取三相洗脫。

2 結果

把亮氨酸添加至必特螺旋霉素發酵中，對于必特螺旋霉素生物合成和菌體生長所產生的影響明顯，生長期結束以后菌濃出現一定的波動，于48～72h內略微上升；發酵后期，因培養基中養分耗盡，且菌體自溶，此時菌濃降低。加入氨基酸以后，菌體于產素期生長以及維持受抑制，此時菌濃下降范圍為1%～5%內。加入氨基酸后的24h內效價增長比較緩慢，加入亮氨酸后期生活效價與對照基本一樣。見圖1。加入亮氨酸后，必特螺旋霉素中異戊酸基螺旋霉素Ⅱ與Ⅲ明顯上升，總異戊酸基螺旋霉素含量也有所提高，而螺旋霉素所占比重則明顯降低。見表1。從該結果來看，亮氨酸可促進必特螺旋霉素中異戊酞螺旋霉素合成。加入亮氨酸后培養基PH和對照相比要高，發酵液中銨離子為3.5nmol/L，糖耗速率為0.3～0.5g/(L?h)。當加入亮氨酸時，檸檬酸合成酶和丙酮酸羧化酶活性均發生顯著改變，同時初級以及次級代謝所受影響不大，對此效價也未發生較大改變，但必特螺旋霉素中總異戊酞螺旋霉素組份含量卻明顯上升。見圖2。必特螺旋霉素為短鏈脂肪酸單體通過聚酮合成酶頭尾縮合而形成，而這些短鏈酯酸酶濃度對于其生物合成可產生較大影響。加入亮氨酸后，乙酸濃度未發生顯著改變，胞外丙酸與對照大致一樣，胞外異戊酸濃度顯升高，于84h可達至166mmol/L，丁酸變化情況和對照基本一致，從該結果可知，加入亮氨酸對于丙酸以及乙酸的影響較小，效價變化小，而必特螺旋霉素中異戊酞基螺旋霉素組分所占比重明顯上升，可見亮氨酸通過分解代謝后所產生的這種異戊酸基CoA能當作螺旋霉素4”側鏈前體。

圖1 添加亮氨酸至比特螺旋霉素發酵過程表示注：1表示對照,2表示亮氨酸

表1 亮氨酸對必特螺旋霉素組分的影響分析

圖2 添加亮氨酸時檸檬酸合成酶和丙酮酸羧化酶活性變化情況注：1表示48h,2表示60h

3 討論

必特螺旋霉素屬于大環內酯類抗生素，基于螺旋霉素，經4”-O異戊酞基轉移催化，于4”位置上和一系列酞基相接入，以此形成為多組分酞化螺旋霉素，同時該抗生素目前已通過Ⅱ期臨床研究，其組分中所含戊酞組分量對于其生物活性可產生較大影響[4-5]。經藥效研究發現，必特螺旋霉素所具體外抗菌譜較廣，毒性較低，其藥效和乙酰螺旋霉素大致一樣，于體內具有較好穩定性[6]。大環內酯類抗生素內酯環形成所需前體物質有乙酸、丁酸以及丙酸，上述這些物質均來自糖酵解途徑、氨基酸代謝、三羧酸循環和脂肪酸，不管是在初級代謝，還是在次級代謝中所扮演的角色均非常重要[7-8]。本次研究就必特螺旋霉素發酵組分中亮氨酸的影響進行了研究分析，亮氨酸屬于一種支鏈氨基酸，聯合異亮氨酸、纈氨酸，可修復肌肉，可快速分解轉化成為葡萄糖，有效控制血糖，提供相應的能量給身體組織。通過研究分析發現，加入亮氨酸對于必特螺旋霉素生物效價所產生的影響不是很顯著，但可使異戊酸基螺旋霉素含量顯著上升。加入亮氨酸以后，乙酸和丙酸未發生顯著變化。同時本次研究還發現，當發酵進行至36h時加入亮氨酸，異戊酸基螺旋霉素組分所占比例明顯上升，可見，亮氨酸通分解代謝后，所產生的這種異戊酸基Co A能被當作螺旋霉素4”側鏈前體。此外，胞外異戊酸于48小時后積累于胞外，而后又在此被重新吸收至胞內。加入亮氨酸以后和對照相比，發酵前期和中期效價均略低，結束時略高，究其原因可能是因糖耗速率和EMP途徑代謝通量相比，稍微下降，繼而造成前期效價比對照稍微低一些，而在后期則因乙酸積累，可使大環合成前體物質得到補充，因此效價稍微上升。

綜上所述，亮氨酸作為支鏈氨基酸，有利于必特螺旋霉素發酵中組分以及效價的優化。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2016.9.015

湖北 448000 荊門市第二人民醫院 （杜仙娥 付聯群 李紅梅）