曲尼司特對犬自體靜脈移植術后再狹窄的影響

馬英初，孫成林

（1.沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院 放射科，遼寧 沈陽110024；2.普外一科）

自體靜脈移植被廣泛應用于治療動脈閉塞性疾病，但由于術后再狹窄嚴重影響了遠期療效。血管平滑肌細胞(VSMC)的異常增殖是靜脈移植術后再狹窄的主要病理基礎[1,2]，在血管內膜增生及血管重塑中起重要作用。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是腎素血管緊張素系統(tǒng)的關鍵效應分子，可刺激VSMC肥大和增殖，導致血管壁增厚、管腔縮小進而導致血管狹窄，在血管重構中占重要地位[3]。在人、犬血管組織中AngⅡ的生成主要是由糜酶介導的[4]。曲尼司特作為一種能穩(wěn)定肥大細胞膜的抗過敏藥，對糜酶的釋放及其介導的AngⅡ的生成起一定的抑制作用，本研究通過建立犬自體靜脈移植模型觀察曲尼司特對其術后再狹窄的影響。

1　材料與方法

1.1　試劑和器材

曲尼司特 (中國藥科大學制藥有限公司)，PCNA抗體及SP免疫組化染色試劑盒（武漢Boster公司），Trizol試劑盒購自BBI公司等；圖像分析采用電子計算機圖像分析儀(Luzex-F NIRECO)。

1.2　動物分組及模型的建立

成年健康犬12只，雌雄不限，體重約為10 kg。隨機分為兩組各6只：實驗組每日給予曲尼司特50 mg/kg，對照組給予等量生理鹽水。喂藥采用強制灌胃法，喂藥一周后行靜脈移植術。術后繼續(xù)用藥兩周（劑量同前）。

3%戊巴比妥鈉（35 mg/kg）麻醉后，取頸部豎切口，游離出左側頸靜脈和頸總動脈，取頸靜脈的分支長約2 cm，將頸靜脈間置移植于頸總動脈，吻合通暢后縫合切口。術后2周處死取材，取材血管分成兩部分，用于形態(tài)學觀察的部分常規(guī)福爾馬林固定，用于測定糜酶mRNA的部分經0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈后放入液氮保存。對照組未手術側正常頸靜脈分支作為空白對照組。

1.3　形態(tài)學觀察

靜脈血管常規(guī)福爾馬林固定、包埋，HE及彈力纖維染色，電子計算機圖象分析儀觀察內膜厚度變化（血管橫截面內膜，每60度測量1次該處內膜厚度，共6處，計算平均厚度）。

1.4　增殖細胞核抗原（PCNA）的觀察

標本用PCNA抗體，SP法染色，定位于細胞核內，陽性結果為細胞核呈棕褐、棕黃、淺黃色。非移植頸靜脈作為空白對照，計數(shù)每個視野PCNA陽性細胞數(shù)，以陽性細胞為分子計算PCNA表達指數(shù)并用百分比表示。

1.5　局部血管糜酶mRNA表達的測定

采用RT-PCR檢測糜酶mRNA的表達，樣品總RNA提取采用Trizol試劑盒，操作按試劑盒說明進行。chymase 上游引物：5’-gag gca gaa gct gag gag atc at-3’；下游引物：5’-gag cct gat cca ttg act tat ct-3’；產物長度：431 bp。擴增產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描，軟件分析并計算chymase/β-actin吸光度(A)的比值。

1.6　統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0進行分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示，行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1　靜脈內膜厚度(mm)及PCNA指數(shù)(%，±s)

表1　靜脈內膜厚度(mm)及PCNA指數(shù)(%，±s)

注:*與空白對照組比較，P＜0.05；△與對照組比較，P＜0.05

組別　空白對照組　對照組　實驗組內膜厚度　0.34±0.19　1.87±0.74*　1.17±0.39*△PCNA 指數(shù)　0.21±0.13　32.14±3.87*17.62±2.81*△

圖1　各組糜酶mRNA的表達結果

2　結果

2.1　形態(tài)學觀察結果

靜脈移植術后對照組可見移植靜脈內膜比正常非移植靜脈內膜增生明顯(P＜0.05)，應用曲尼司特后，與正常非移植靜脈相比移植靜脈內膜有所增生(P＜0.05)，但與對照組相比移植靜脈內膜增生受到抑制，內膜的平均厚度均減少(P＜0.05)（表1）。

2.2　PCNA免疫組織化學結果

正常靜脈平滑肌細胞僅極少呈PCNA染色陽性，對照組術后內膜與中膜SMC的PCNA陽性細胞明顯增多，而實驗組PCNA指數(shù)均低于對照組，兩者之間差異有顯著性(P＜0.05)（表1）。

2.3　糜酶mRNA的表達結果

對照組血管糜酶表達較空白對照組明顯增加(P＜0.05)；曲尼司特組較對照組明顯下降 (P＜0.05)，接近空白對照組,與之比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)(圖 1)。

3　討論

近年研究證實，靜脈移植術后再狹窄的重要原因為血管平滑肌細胞和內皮細胞增生，而AngⅡ被認為在此過程中起重要作用。人體局部組織（包括血管、腦、心等）存在著腎素-血管緊張素系統(tǒng)，能分泌血管緊張素，在調節(jié)肌性內膜對血管損傷所發(fā)生的增生反應方面起重要作用[3]。很多動、靜脈壁均有血管緊張素轉換酶及其特異的AngⅡ受體[5]，當AngⅡ與AngⅡ受體結合作用于VSMC，可刺激c-fos和c-myc原癌基因的表達，由于這些基因產物的介導作用，使VSMC表型轉換，由收縮型轉變成分泌型，并產生彈性蛋白、糖氨多糖及膠原等(形成再狹窄病變的主要成分)，導致靜脈VSMC增生[6]、血管狹窄。

人類心血管系統(tǒng)存在多種非血管緊張素轉化酶(ACE)依賴的血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)生成途徑，其中又以糜酶(chymase)途徑最為重要。糜酶在正常血管組織中以非活性形式貯存于肥大細胞內，免疫組化及原位雜交等實驗方法都表明肥大細胞的分泌顆粒是合成和貯存糜酶的場所，當肥大細胞受到如血管移植、導管損傷等強烈刺激時隨即被激活，并馬上將糜酶釋放到細胞外基質，與底物AngⅠ結合生成AngⅡ，使AngⅡ濃度迅速升高，這表明糜酶主要在病變血管生成AngⅡ起重要作用[7,8]。本研究亦發(fā)現(xiàn)靜脈移植術后局部血管糜酶的mRNA表達顯著增加，而曲尼司特能明顯抑制其表達。

在犬頸動脈球囊損傷模型中，Takai等[9]發(fā)現(xiàn)損傷后的頸動脈局部內膜增生同時糜酶活性增大，而ACE活性無變化。給予糜酶抑制劑NK 3201后，局部頸動脈血管的糜酶活性被明顯抑制，與對照組比較血管內膜增生面積明顯減小，而血漿腎素和ACE活性無變化。提示NK3201通過抑制糜酶起到預防球囊損傷動脈的內膜增生的作用。說明糜酶主要調節(jié)損傷的血管局部AngⅡ水平，而在正常血管組織和整體中對AngⅡ生成影響基本不起作用。

在本研究中發(fā)現(xiàn)正常靜脈PCNA陽性細胞很少，提示細胞大多處于增殖靜止期，而在移植血管中陽性細胞很多，說明細胞增殖活性明顯增大，PCNA在血管細胞中陽性率與血管內膜增生程度呈正相關。研究還觀察到，移植術后血管內膜的平均厚度和PCNA表達在實驗組均降低，表明曲尼司特對移植靜脈增生內膜的PCNA表達有抑制作用。靜脈移植術可導致糜酶的mRNA表達增加伴有細胞增殖和內膜增厚的現(xiàn)象，而曲尼司特通過抑制糜酶mRNA的表達減輕細胞增殖和內膜增厚的程度。曲尼司特作為一種能穩(wěn)定肥大細胞膜的抗過敏藥，可對糜酶的釋放及其介導的AngⅡ的生成起一定的抑制作用，進而起到降低靜脈移植術后再狹窄的效應。

總之，本研究通過建立犬靜脈移植模型觀察到曲尼司特對糜酶介導的血管組織增殖有抑制作用，證實了糜酶途徑在AngⅡ增高所致的VSMC增殖相關性疾病中起著重要作用，通過藥物阻斷糜酶途徑進而抑制VSMC增殖，為臨床治療VSMC增殖相關性疾病(如血管移植術后再狹窄等)提供了一條新途徑。