發酵蔬菜汁替代亞硝酸鹽在牛肉灌腸中的應用

張甜，關倩霞，楊華（山西農業大學食品科學與工程學院，山西太谷030801）

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發酵蔬菜汁替代亞硝酸鹽在牛肉灌腸中的應用

張甜，關倩霞，楊華*
（山西農業大學食品科學與工程學院，山西太谷030801）

摘要：研究發酵蔬菜汁替代化學合成亞硝酸鹽在牛肉腸中的作用效果。以木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌作為發酵劑，不同添加量（5%、10%、15%和20%）的菠菜汁和胡蘿卜汁為試驗組制作牛肉腸，添加亞硝酸鹽（添加0.01%）組為對照組，通過模糊綜合評價法和牛肉腸的亞硝酸鹽含量篩選最佳蔬菜汁；比較無亞硝酸鹽蔬菜汁組、亞硝酸鹽蔬菜汁組和發酵蔬菜汁組3種不同處理方式的牛肉灌腸在貯藏期間菌落總數、TBARS值、TVB-N、pH和色差的變化。添加15%和20%發酵菠菜汁制作的牛肉灌腸感官評價均較好，但是20%的發酵菠菜汁在24h的亞硝酸鹽殘留量達到31.137mg/kg，超出國標允許范圍內，所以選擇15%的發酵菠菜汁。在貯藏過程中，添加15%發酵菠菜汁制作的蔬菜牛肉發酵腸的微生物指標、理化指標和肉色指標與添加0.01%亞硝酸鹽制作的牛肉灌腸相當。本研究得出在牛肉灌腸制作中，供試菌發酵15%菠菜汁產生亞硝酸鹽可替代直接添加0.01%化學合成亞硝酸鹽。

關鍵詞：發酵蔬菜汁；牛肉灌腸；亞硝酸鹽；替代

發酵香腸是西方國家將其傳統制品與現代生物技術結合而開發出的一類高檔肉制品，是指將絞碎的肉（通常為豬肉或牛肉）、動物脂肪、鹽、發酵劑和香辛料等混合后灌進腸衣，在自然或人工控制條件下，經過微生物發酵作用而產生的具有特殊風味、色澤和質地，且具有較長保存期的肉制品［1-2］。在肉腌制時加入亞硝酸鹽能夠使肉品產生誘人的紅色，起到抗氧化和提高風味的作用，對肉毒梭狀芽孢桿菌具有抑制其產生毒素的作用，從而保證肉制品的安全［3-4］，盡管其能夠起到許多有益作用，但亞硝酸鹽能與肉制品中的次級胺作用生成N-亞硝基化合物，具有強致癌性［5］，嚴重威脅著人們的健康。因此，尋找亞硝酸鹽在肉制品中的替代物是近年來國內外學者關注的焦點。有研究報道肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌和一些微球菌能產生硝酸鹽還原酶，將硝酸鹽轉化為亞硝酸鹽［6］。李沛然［7］研究表明自制發酵芹菜粉能夠作為一種替代合成型亞硝酸鈉的天然腌制劑。Krause［8］將富含硝酸鹽的蔬菜與具有硝酸鹽還原作用的肉葡萄球菌發酵系統反應，生成了200 mg/kg～230 mg/kg的亞硝酸鹽，并且加入發酵芹菜的灌腸在42 d內與加入亞硝酸鈉的灌腸在紅度方面沒有明顯差異（P＞0.05），亞硝酸鈉組在一個星期內的亞硝酸鹽殘留量顯著高于發酵芹菜組（P＜0.05）。說明利用微生物對肉制品發酵，可以促進肉的發色作用，減少亞硝酸鹽殘留量，從而提高肉制品的安全性。

本研究利用肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌混和發酵胡蘿卜汁、菠菜汁產生亞硝酸鹽來代替直接添加亞硝酸鹽生產蔬菜牛肉發酵腸，研究其替代效果，為開發這種新型食品提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1原料

新鮮菠菜、紅蘿卜、牛背最長肌、天然腸衣：均購于本地的農貿市場。

1.1.2供試菌

肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌：購買于意大利SACCO公司。

1.1.3主要輔料和試劑

玉米淀粉、胡椒粉、桂皮、八角、小茴香、良姜、陳皮、亞硝酸鹽：均為食品級；2-硫代巴比妥酸、氯仿、二氯化汞、氨基苯磺酸、鹽酸萘胺、硼酸、氧化鎂：均為分析純。

1.2主要儀器與設備

ZB-5型斬拌機：上海青浦食品包裝機械廠；HPP-9272型電熱恒溫培養箱：北京東聯哈爾儀器制造有限公司；YXD-912型自動控溫食品電烤爐：瑞安市宏威食品機械廠；SP-XC-ZK01型臺式真空包裝機：晉中佳通機電科技有限公司；SHZ-B型水浴恒溫振蕩器：上海躍進醫療器械廠；2100型分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；FA25型高剪切分散乳化機：上海弗魯克流體機械制造有限公司；LD5-2B型低速離心機：北京需勃爾醫療機械有限公司；SP-XC-SD01型酸度計：晉中佳通機電科技有限公司；TCPZ型全自動測色色差計：北京鑫奧依克光電技術有限公司。

1.3試驗設計

以牛肉、菌種的添加量（肉重的0.02%）為定量，添加0.01%亞硝酸鹽為對照組，胡蘿卜汁和菠菜汁的添加量以5%、10%、15%、20%分別與牛肉混合制成8組牛肉灌腸，用感官評價和亞硝酸鹽的含量為評定指標，挑選出最佳方案進行貯藏試驗。

用最佳方案的蔬菜汁種類和添加量為定量制作3組灌腸，分別為無亞硝酸鹽陰性對照組：蔬菜汁；亞硝酸鹽陽性對照組：0.01%亞硝酸鹽、蔬菜汁；發酵試驗組：0.02%菌種、蔬菜汁。

獨立真空包裝后在4℃冰箱中冷藏。分別在貯藏期的0、1、4、7、14、21 d測定3組灌腸的菌落總數、亞硝酸鹽殘留量、TBARS值、TVB-N值、pH值、色差

1.4工藝流程

操作要點：

原輔料處理：牛肉去除筋腱、較厚的肌外膜切分成1 cm3小丁塊，胡蘿卜、菠菜汁經清洗切分勻漿后置于冰箱中保鮮備用，稱量0.02%肉重的菌種添加到50 mL滅菌的牛奶（含1.4%葡萄糖）中并常溫放置3 h以活化菌種，桂皮、八角、小茴香、良姜、陳皮按質量比為1∶3∶2∶2∶1的比例熬制香辛料水并置于冰箱中備用；

腌制：牛肉中加入肉重的10%香辛料水、2%鹽、1%蔗糖、2%蒜、0.2%味精、1%料酒、1%醬油、0.2%胡椒粉，攪拌均勻后置于4℃的冰箱中12 h；

拌料：8個試驗組分別添加肉重的5%、10%、15%、20%的胡蘿卜汁和同水平的菠菜汁、0.02%菌種、7%淀粉并攪拌均勻，對照組添加0.01%亞硝酸鹽、7%淀粉后混勻；

發酵：8個試驗組在38℃恒溫培養箱中發酵4 h，對照組在4℃冰箱放置4 h；

煮制：70℃～80℃水中煮制15 min；

烤制：50℃電烤爐中烤制30 min。

1.5指標測定方法

1.5.1感官評分標準

10位身體狀態良好、具有一定食品科學知識的感官評定員對9個樣品進行色澤、風味、口感、質地方面的感官評價。鑒于各位感官評定員對相似樣品的評價會有一定的模糊性和主觀性，為得到更客觀的實際結果，應用模糊綜合評價方法來分析數據。

模糊綜合評價的數學模型：

設定論域U=｛色澤，風味，口感，質地｝；設定評語集V=｛很好，好，一般，差｝，其中，很好（4分）、好（3分）、一般（2分）、差（1分）；確定評價指標權重集A= （0.2，0.2，0.3，0.3），即色澤2分，風味2分，口感3分，質地3分，共10分；模糊關系綜合評判集Y = A·R，R為模糊矩陣。

表1　9組牛肉灌腸的感官評定標準Table 1 Sense assessing standard of 9 groups beef sausage

1.5.2亞硝酸鹽含量的測定

參考國標法中的分光光度法［9］。

1.5.3菌落總數的測定

牛肉灌腸在4℃冷藏期間測定0、1、4、7、14、21 d的菌落總數，參照GB 4789.2-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗-菌落總數測定》中的方法測定［10］。

1.5.4TBARS值的測定

TBARS值的測定參照Vyncké［11］、S?rensen和J?rgensen［12］的方法。

牛肉灌腸在4℃冷藏期間測定0、1、4、7、14、21 d 的TBARS值。

1.5.5揮發性鹽基氮的測定

牛肉灌腸在4℃冷藏期間測定0、1、4、7、14、21 d 的TVB-N，采用半微量定氮法，參考GB/T 5009.44-2003《肉與肉制品衛生標準的分析方法》［13］。

1.5.6酸堿度的測定

牛肉灌腸在4℃冷藏期間，測定0、1、4、7、14、21 d 的pH。精確稱量5 g灌腸碎樣，加入15 mL蒸餾水，勻漿30秒后測定pH。

1.5.7色差測定

牛肉灌腸在4℃冷藏期間，用色差計測定0、1、4、7、14、21 d的色差。

1.6數據分析

運用Statistix8.1分析軟件對測定指標進行顯著性分析，比較方法為Tukey HSD，Alpha為0.05；利用SigmaPlot10軟件作圖。

2　結果與分析

2.1最佳蔬菜汁添加量試驗

2.1.1蔬菜汁的添加量對灌腸感官品質的影響按照模糊綜合評價法對表2進行評定。

表2　不同蔬菜添加量的灌腸的感官評定結果Table 2 Sensory evaluation results of fermented vegetable beef sausage for different vegetable additive

從表2可以看出不加蔬菜汁的亞硝酸鹽組的產品感官評價為很好，菠菜汁組添加5%和10%的產品評價均為很好或好，添加15%和20%的評價為好或一般；胡蘿卜汁組添加10%的產品評價為很好或好，添加15%和20%的評價為好或一般。與亞硝酸鹽對照組相比，添加菠菜汁或胡蘿卜汁的發酵腸感官品質較差。2.1.2亞硝酸鹽的含量變化

亞硝酸鹽的含量變化見表3。

表3　不同組別灌腸亞硝酸鹽的含量Table 3 Nitrite contents of fermented vegetable beef sausage in different groups　mg/kg　

由表3可以看出，隨著時間延長，亞硝酸鹽對照組的亞硝酸鹽殘留量呈下降趨勢，差異顯著（P＜0.05）。對于蔬菜汁組，除了5%菠菜汁組外，其余各組亞硝酸鹽殘留量隨著時間延長呈顯著上升趨勢（P＜0.05）。同一時間內，亞硝酸鹽對照組的亞硝酸鹽殘留量遠遠高于蔬菜組（P＜0.05）。菠菜汁組在同一時間內，隨著菠菜汁添加量的增加，亞硝酸鹽殘留量呈顯著升高的趨勢（P＜0.05），分別以添加5%和20%時表現最低和最高。胡蘿卜汁組在同一時間內，隨著胡蘿卜汁添加量的增加，亞硝酸鹽殘留量呈現上升趨勢，5%和10%添加量組差異不顯著（P＞0.05），15%和20%添加量組在12 h和24 h亞硝酸鹽殘留量差異顯著（P＜0.05）。蔬菜汁組以20%菠菜汁在24 h測得的亞硝酸鹽殘留量最高，達到31.137 mg/kg。

2.2貯藏期間的品質變化

由于胡蘿卜汁組的亞硝酸鹽含量都很低，不作為貯藏試驗的考慮對象。雖然15%和20%的菠菜汁的感官評價均較好且測得的亞硝酸鹽殘留量較高，但是20%的菠菜汁在24 h其殘留量超過了國標規定的亞硝酸鹽殘留量，所以綜合考慮以15%的菠菜汁添加量進行貯藏試驗，研究比較其與0.01%亞硝酸鹽的菠菜牛肉灌腸的品質優劣。

2.2.1不同組別牛肉灌腸菌落總數的變化

不同組別牛肉灌腸菌落總數的變化見圖1。

圖1　不同組別灌腸在貯藏期間菌落總數的變化Fig.1 Aerobic bacterial county changes of sausage in different groups during storages

從圖1可以看出，3組灌腸在貯藏期間，菌落總數呈顯著上升趨勢（P＜0.05），其中無亞硝酸鹽對照組的上升幅度最大。除第21天外，亞硝酸鹽對照組與發酵試驗組差異不顯著（P＞0.05）。以菌落總數看，利用菌種發酵菠菜汁產生亞硝酸鹽在抑菌效果方面與添加化學合成亞硝酸鹽相當。貯藏4 d內菌落總數增長緩慢，原因是在真空包裝環境下，微生物要重新調整代謝以適應缺氧環境；4 d后菌落增長速度加快。

2.2.2不同組別牛肉灌腸亞硝酸鹽殘留量的變化

不同組別牛肉灌腸亞硝酸鹽殘留量的變化見圖2。

圖2　不同組別灌腸在貯藏期間亞硝酸鹽殘留量的變化Fig.2 Changes of nitrite residues of sausage in different groups during storages

從圖2可以看出，在貯藏期內，3組灌腸的亞硝酸鹽殘留量差異顯著（P＜0.05），亞硝酸鹽組最高，不添加亞硝酸鹽組最低，隨著貯藏期的延長，亞硝酸鹽殘留量有逐漸升高的趨勢（P＜0.05），這是因為在貯藏期間菠菜與細菌作用產生了微量的亞硝酸鹽。亞硝酸鹽組在貯藏14 d后亞硝酸鹽下降緩慢，殘留量接近46 mg/kg。發酵組中亞硝酸鹽的含量均低于亞硝酸鹽組，高于無亞硝酸鹽組，在第1天時最高，接近29 mg/kg，隨后下降趨勢顯著（P＜0.05），符合國際亞硝酸鹽殘留量低于30mg/kg的規定。可見，發酵組優于亞硝酸鹽組。

2.2.3不同組別牛肉灌腸TBARS值的變化

不同組別牛肉灌腸TBARS值的變化見圖3。

圖3　不同組別灌腸在貯藏期間TBARS值的變化Fig.3 Changes of TBARS value of sausage in different groups during storages

TBARS是檢測油脂氧化產物丙二醛的含量反映樣品的氧化程度，數值越大，脂質氧化越嚴重。3組灌腸的TBARS值都隨時間的延長而增大（P＜0.05），同一時間內，無亞硝酸鹽組TBARS數值最大，脂質氧化程度最高；除第21天外，發酵組與亞硝酸鹽組TBARS值差異不顯著（P＜0.05），表明通過菌種發酵可以抑制脂質過氧化。

2.2.4不同組別牛肉灌腸TVB-N值的變化

不同組別牛肉灌腸TVB-N值的變化見圖4。

圖4　不同組別灌腸在貯藏期揮發性鹽基氮值的變化Fig.4 Changes of TVB-N value of sausage in different groups during storages

揮發性鹽基氮值是表示肉制品新鮮度的一個指標，數值越大，新鮮度越低。國家規定：鮮肉≤20 mg/ 100 g；變質肉> 20 mg/100 g。由圖4可以看出，3組灌腸的TVB-N值隨貯藏時間的延長均呈上升趨勢（P＜0.05），7 d前，上升緩慢，后期上升速度加快。同一貯藏期內，無亞硝酸鹽組TVB-N值最大，發酵組次之，亞硝酸鹽組最小。第21天時，3組灌腸的TVB-N值都低于15 mg/100 g，新鮮度在鮮肉范圍內，這是真空包裝、低溫冷藏和亞硝酸鹽可抑菌等共同作用延緩了腐敗變質。無亞硝酸鹽組因亞硝酸鹽含量微乎其微，新鮮度比另外兩組差。

2.2.5不同組別灌腸制品pH的變化

不同組別灌腸制品pH的變化見圖5。

圖5　不同組別灌腸在貯藏期間pH的變化Fig.5 Changes of pH of sausage in different groups during storages

從圖5可以看出，3組灌腸在貯藏1 d時pH下降，隨后均呈上升的趨勢（P＜0.05），但上升幅度不大。在同一貯藏期內，貯藏時間超過1天后發酵組的pH比無亞硝酸鹽組和亞硝酸鹽組的都低，基本上都低于6.0，這更助于亞硝酸鹽發揮抑菌作用和呈色作用。

2.2.6不同組別灌腸制品a*值的變化

不同組別牛肉灌腸a*值的變化見圖6。

圖6　不同組別灌腸在貯藏期間a*值的變化Fig.6 Changes of a* value of sausage in different groups during storages

牛肉的顏色是紅色的，由于菠菜汁的添加，3組灌腸的顏色總體偏向綠色。由圖6可知，除第21天外，a*值都是負值。除第14天外，發酵組與亞硝酸鹽組a*值差異不顯著（P＞0.05）；發酵組與亞硝酸鹽組a*值差異顯著（P＜0.05）。總體來看，a*值有上升趨勢，以無亞硝酸鹽組更為明顯（P＜0.05）。a*值變化與葉綠素的降解和亞硝酸鹽的顯色作用有關。

2.2.7不同組別牛肉灌腸b*值的變化

不同組別牛肉灌腸b*值的變化見圖7。

圖7　不同組別灌腸在貯藏期間b*值的變化Fig.7 Changes of b* value of sausage in different groups during storages

b*值表示黃藍，正值是偏向黃色，負值偏向藍色。b*值越大，肉的色澤感覺越差。由圖7可以看出，在貯藏期間，3組灌腸的b*值都是正值，且呈現波浪狀的變化。在整個貯藏期間，不同組之間的差異顯著性不斷在改變。b*值上的差異與菠菜中各色素的變化有關，葉綠素性質不穩地，隨貯藏時間的延長不斷損失，使呈黃色的類胡蘿卜素占優勢，即菠菜逐漸由綠色變為黃色［14］。

3　討論

3.1胡蘿卜汁與菠菜汁的選擇

本研究中，相同添加水平的胡蘿卜汁組和菠菜汁組，灌腸產品的感官綜合評價基本相同，菠菜汁組灌腸亞硝酸鹽產生量是胡蘿卜汁組的10倍以上，但是比亞硝酸鹽組亞硝酸鹽殘留量更低，兼顧健康和產品品質的要求，選擇菠菜汁組。在菠菜汁組，15%添加量和20%添加量組感官綜合評價和亞硝酸鹽殘留量均高，但是20%添加量組在24 h的亞硝酸鹽殘留量超出了國標規定的范圍，所以，在制作蔬菜牛肉發酵腸時，選擇15%菠菜汁。

3.2影響亞硝酸鹽殘留量的因素

在酸性環境下，灌腸中的一些還原性物質將亞硝酸鹽分解成NO，其與肌紅蛋白結合形成穩定的亞硝基肌紅蛋白，肌紅蛋白越多，消耗的亞硝酸鹽就越多。牛肌肉中肌紅蛋白的含量與品種、年齡、性別、運動量、肌肉部位有關。年齡越大、運動量越多的公牛含更多的肌紅蛋白，牛的部位中腿肉、臀肉比里脊、眼肉、外脊多。肉中的pH會影響到亞硝酸鹽與肌紅蛋白的呈色作用，pH在5.6～6.0能更好地發色。同時牛肉越新鮮、腌制溫度越高、時間越長亞硝酸鹽的殘留量也越少［15-16］。亞硝酸鹽也可作為抗氧化劑抑制脂質氧化，脂肪含量也影響其殘留量。

4　結論

選擇15%菠菜汁制作的蔬菜牛肉發酵腸在貯藏過程中，其微生物指標、理化指標和肉色指標與添加0.01%亞硝酸鹽制作的牛肉灌腸相當。在牛肉灌腸制作中，供試菌發酵15%菠菜汁產生亞硝酸鹽可替代直接添加0.01%化學合成亞硝酸鹽。

參考文獻：

［1］孫來華，李桂榮.羊肉發酵香腸的研制［J］.食品科技，2005（4）：46-48，50

［2］羅欣，朱燕.發酵香腸加工技術及品質控制研究［J］.食品與發酵工業，2007，27（1）：3-6

［3］Honikel K. The use and control of nitrate and nitrite for the processing of meat products［J］. Meat Science，2008，78：68-76

［4］Sebranek J G，Bacus J N. Cured meat products without direct addition of nitrate or nitrite：What are the issues？［J］. Meat Science，2007，77：136-147

［5］周光宏.畜產品加工學［M］.中國農業出版社，2013：98-105

［6］趙亞娟，郇延軍，孫冬梅，等.木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌的生理特性及其轉化硝酸鹽影響因素的研究［J］.食品工業科技，2012 （5）：63-66.

［7］李沛然.發酵芹菜粉制備及在灌腸中應用效果研究［D］.天津農學院碩士學位文，2014：6

［8］Krause B L，Sebranek J G，Rust R E，et al. Incubation of curing brines for the production of ready-to-eat，uncured，no-nitrite-ornitrate-added，ground，cookedandslicedham［J］. Meat science，2011，89（4）：507-513

［9］中華人民共和國衛生部. GB 5009.33-2010.食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定［S］.北京：中國標準出版社，2010：4-8

［10］中華人民共和國衛生部. GB4789.2-2010食品安全國家標準食品微生物學檢驗-菌落總數測定［S］.北京：中國標準出版社，2010：1-5

［11］Vyncké WE. Valuation of the direct thiobarbituric acid extraction method for determining oxidative rancidity in mackerel（Scomber scombrus L.）［J］. Fette，Seifen，Anstrichmittel，1975，77：239-240

［12］S?rensen G，J?rgensen SS. A critical examination of some experimental variables in the 2-thiobarbituric acid（TBA）test for lipid oxidation in meat products［J］. Zeitschrift für Lebensmittelunter-suchung-und Forsh chung A，1996，202：205-210

［13］中華人民共和國衛生部和中國國家標準化管理委員會. GB/T 5009.44-2003.肉與肉制品衛生標準的分析方法［S］.北京：中國標準出版社，2003：4

［14］刁恩杰，李向陽，丁曉雯.脫水菠菜貯藏過程中顏色變化動力學［J］.農業工程學報，2010，26（8）：350-354

［15］姚偉艷，張小英.肉制品中亞硝酸鹽殘留的控制［J］.肉類工業，2006 （11）：5-7

［16］唐愛明，夏延斌.肉制品中亞硝酸鹽降解方法、機理及研究進展［J］.食品與機械，2004，20（4）：35-37

The Application of Fermented Vegetable Juice Instead of Nitrite in the Beef Sausage

ZHANG Tian，GUAN Qian-xia，YANG Hua*
（College of Food Science and Engineering，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，Shanxi，China）

Abstract：To study the effects of nitrite produced by bacteria fermented vegetable juice in place of chemical synthesis of nitrite. Staphylococcus xylosus and Staphylococcus carnosus as a leavening agent，fermented vegetable beef sausage was made with different supplementation（5%，10%，15%and 20%）spinach and carrots juice as experiment groups. Group nitrite（additive of 0.01%）was control group. Proper vegetable juice was selected by fuzzy comprehensive evaluation and nitrite contents of fermented sausages. Changes of aerobic bacterial county，TBARS，TVB-N，pH and colour of beef sausages made using vegetable juice alone，nitrite and vegetable juice，and fermented vegetable juice were compared during the storages. The fermented sausage with 15% and 20%spinach juice were both better by comprehensive sensory evaluation，but the content of nitrite of 20% spinach juice was up to 31.137 mg/kg，out of the allowable range of the national standard，so we select the 15% spinach juice. During the storages，microbial，physicochemical and colour indexes of fermented vegetable beef sausage with 15%spinach juice were equal to those of beef sausages made using 0.01%nitrite. The nitrite produced using 15%spinach juice fermented by bacteria tested could be directly in place of 0.01%chemical synthesis of nitrite in the process of beef sausage.

Key words：fermented vegetable juice；beef sausage；nitrite；replace

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.006

基金項目：山西省自然科學基金（2013011033-2）

作者簡介：張甜（1990—），女（漢），碩士生，研究方向：畜產品加工原理及技術。

*通信作者：楊華（1979—），女（漢），博士，研究方向：肉品科學與技術。

收稿日期：2016-02-06