魚肉蛋白- D-木糖MRPs抗氧化活性的研究

章銀良，盧慢慢，張陸燕（鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，河南鄭州450001）

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魚肉蛋白- D-木糖MRPs抗氧化活性的研究

章銀良，盧慢慢，張陸燕
（鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，河南鄭州450001）

摘要：為分析實際體系美拉德反應產物（MRPs）的抗氧化活性，采用4種不同品種魚肉（鰱魚、草魚、鯽魚和鯉魚）蛋白與D-木糖建立實際體系進行美拉德反應，反應產物通過恒溫油浴加熱制備，以DPPH自由基（DPPH·）作為美拉德反應產物抗氧化活性的測定指標。單因素試驗考察加熱溫度、時間、pH及反應底物質量比對美拉德反應的影響，優化出MRPs抗氧化活性最強的鯽魚蛋白-D-木糖為實際反應體系。均勻試驗結果表明，鯽魚蛋白-D-木糖實際體系MRPs對DPPH自由基的清除率最高，抗氧化活性最強。且最佳工藝條件為：反應時間70min，溫度136℃，初始pH 12.0及反應底物質量比（鯽魚蛋白∶D-木糖）為3∶1。

關鍵詞：美拉德反應；實際體系；抗氧化活性；魚肉；D-木糖

美拉德反應（Maillard reaction，MR）又稱為非酶褐變反應，主要是指在食品加工和儲存的過程中含氨基的化合物（蛋白質、氨基酸及肽類）與含羰基化合物（還原糖）之間發生的一系列復雜反應［1］。美拉德反應是加工食品的色澤和芳香風味的重要來源，其反應歷程可分為3個階段：初級階段，中級階段和高級階段。初級階段主要進行羰氨的縮合及分子重排，生成不揮發性風味物質的前體成分；中級階段主要發生3個途徑，分別是在酸性、堿性和高溫下進行，生成醛類和酮類等物質；高級階段主要發生醇醛的縮合及生成類黑精物質的聚合反應［2-3］。影響美拉德反應的因素有很多，如氨基酸及糖的種類和性質、水分活度、加熱時間、加熱溫度、反應pH、反應底物質量比、金屬離子及緩沖液濃度等［4-6］。美拉德反應最終生成棕色甚至是黑色的大分子物質類黑精或稱擬黑素［7］。MRPs具有多種多樣的生物活性如抗氧化［8］、抗誘變［9］、抗增殖［10］等，尤其是類黑精素、還原酮及一些含N、S的雜環化合物具有較強的抗氧化活性，甚至可與常用的食品抗氧化劑BHA、BHT相媲美［11］。

對于美拉德反應的研究較多集中在模式體系而對實際體系的研究較少，本文以魚肉蛋白-D-木糖建立實際體系進行美拉德反應并制備其產物，以DPPH自由基（DPPH·）作為反應抗氧化活性的測定指標，選出最佳魚肉蛋白-D-木糖實際體系組合，并優化出最佳工藝條件，為后期研究不同加工技術、不同反應溶劑對實際體系美拉德反應的影響打下良好的理論基礎。

1　材料與方法

1.1試驗材料

魚為鰱魚（蛋白含量18.6%）、草魚（蛋白含量16%）、鯽魚（蛋白含量13%）、鯉魚（蛋白含量20%）：河南鄭州高新區蓮花市場；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼），分析純：上海生工生物工程技術服務有限公司；無水乙醇、D-木糖等均為分析純：阿拉丁公司。

1.2主要儀器設備

HH-1智能型數顯恒溫油浴槽：鞏義市予華儀器有限公司；UV-2102pc紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；電子天平：奧豪斯（上海）儀器有限公司；pH計：瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3方法

1.3.1魚肉蛋白-D-木糖實際體系美拉德反應產物的制備

美拉德反應產物的制備參考章銀良［12］等文獻中的制備方法并做適當修改。

首先是鮮魚材料的前處理，魚需進行去頭、去皮、去刺等處理，然后將純魚肉進行絞碎并換算成相應魚蛋白含量的量待用。影響美拉德反應的因素主要有加熱時間、加熱溫度、反應初始pH和反應底物質量比，因此可按上述4個因素依次進行單因素試驗。制備美拉德反應產物的具體操作步驟如下：

1）溫度對美拉德反應產物抗氧化能力的影響：準確稱量鰱魚蛋白（鰱魚肉糜3.36 g）、草魚蛋白（草魚肉糜3.91 g）、鯽魚蛋白（鯽魚肉糜4.81 g）、鯉魚蛋白（鯉魚肉糜3.16 g）分別與D-木糖0.63 g（質量比1∶1）用去離子水進行溶解后調pH為7.0，并定容至25 mL，將反應液轉移至圓底燒瓶中，密封嚴實后，將恒溫油浴鍋調至50℃進行反應60 min，反應結束后迅速將反應液置于冰水中冷卻、過濾、取濾液待用。并按上述方法依次在75、100、125、150、175℃條件下制備美拉德反應液后進行相關測定。

2）加熱時間對美拉德反應產物抗氧化能力的影響：準確稱量鰱魚蛋白（鰱魚肉糜3.36 g）、草魚蛋白（草魚肉糜3.91 g）、鯽魚蛋白（鯽魚肉糜4.81 g）、鯉魚蛋白（鯉魚肉糜3.16 g）分別與D-木糖0.63 g（質量比1∶1）用去離子水進行溶解后調pH為7.0，并定容至25 mL，將反應液轉移至圓底燒瓶中，密封嚴實后，將恒溫油浴鍋調至125℃進行反應30 min，反應結束后迅速置于冰水中冷卻、過濾、取濾液待用。并按上述方法依次加熱60、90、120、150、180 min制備美拉德反應液后進行相關測定。

3）反應初始pH組對美拉德反應產物抗氧化能力的影響：準確稱量鰱魚蛋白（鰱魚肉糜3.36 g）、草魚蛋白（草魚肉糜3.91 g）、鯽魚蛋白（鯽魚肉糜4.81 g）、鯉魚蛋白（鯉魚肉糜3.16 g）分別與D-木糖0.63 g（質量比1∶1）用去離子水進行溶解后調pH為4.0，并定容至25 mL，將反應液轉移至圓底燒瓶中，密封嚴實后，將恒溫油浴鍋調至125℃進行反應60 min，反應結束后迅速置于冰水中冷卻、過濾、取濾液待用。并按上述方法用4 mol/L的HCl溶液和6 mol/L的NaOH溶液依次調pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0制備美拉德反應液后進行相關測定。

4）反應底物對美拉德反應產物抗氧化能力的影響：準確稱量鰱魚蛋白（鰱魚肉糜3.36 g）、草魚蛋白（草魚肉糜3.91 g）、鯽魚蛋白（鯽魚肉糜4.81 g）、鯉魚蛋白（鯉魚肉糜3.16 g）分別與D-木糖0.63 g（質量比1∶1）用去離子水進行溶解后調pH為7.0，并定容至25 mL，將反應液轉移至圓底燒瓶中，密封嚴實后，將恒溫油浴鍋調至125℃進行反應60 min，反應結束后迅速將反應液置于冰水中冷卻、過濾、取濾液待用。并按上述方法依次稱量4種不同魚蛋白和D-木糖質量比為1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1、1∶3、1∶2.5、1∶2、1∶1.5制備美拉德反應液后進行相關測定。

1.3.2DPPH自由基清除能力的測定

根據Yen G等［13］文獻中測定DPPH·清除能力的方法來評價MRPs的抗氧化活性，先配置0. 12 mmol/L的DPPH酒精溶液（最好現用現配），避光保存。取1 mL稀釋50倍后的樣品溶液，再加4 mL DPPH酒精溶液，搖勻，放在室溫條件下避光反應30 min。然后用紫外可見分光光度計在517 nm的條件下測定其吸光度值，記為AS。以相同的方法取1 mL的去離子水代替稀釋后的樣品溶液作為控制組，在517 nm條件下測定其吸光度值，記為Ac。計算DPPH自由基清除率方程式如下所示：

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1不同加熱溫度對美拉德反應產物抗氧化活性的影響

加熱溫度不僅影響著美拉德反應的速度，而且對美拉德反應產物的濃度及它們之間的相互作用也有一定的影響見圖1。

如圖1所示，在加熱初期，MRPs對DPPH自由基的清除率隨著溫度的升高增加緩慢。隨后則隨著加熱溫度的升高幾乎呈線性趨勢增加，在150℃時，4個組合的抗氧化活性均達到最強，可知MRPs中的抗氧化活性物質在高溫條件下更有利于生成，其中鯽魚蛋白-D-木糖組合的清除率為17.98%，略高于其它3個組合。

圖1　不同加熱溫度下實際體系MRPs對DPPH自由基清除率的變化Fig.1 The change of different heating temperatures on DPPH radical scavenging activity of actual system MRPs

2.1.2不同加熱時間對美拉德反應產物抗氧化活性的影響

不同加熱時間對美拉德反應產物抗氧化活性的影響見圖2。

圖2　不同加熱時間下實際體系MRPs對DPPH自由基清除率的變化Fig.2 The change of different heating time on DPPH radical scavenging activity of actual system MRPs

由圖2可以看出，加熱時間對美拉德反應抗氧化活性物質的生成具有較強的影響力，隨著加熱時間的延長，4個組合MRPs對DPPH自由基的清除率均顯著增強。

2.1.3不同反應初始pH對美拉德反應產物抗氧化活性的影響

不同反應初始pH對美拉德反應產物抗氧化活性的影響見圖3。

圖3　不同反應初始pH下實際體系MRPs對DPPH自由基清除率的變化Fig.3 The change of different reaction initial pH on DPPH radical scavenging activity of actual system MRPs

由圖3可知，酸性和堿性條件有利于美拉德反應抗氧化活性物質的生成，在pH7.0～12.0的范圍內，MRPs的抗氧化活性逐漸增加，可能是由于隨著pH的增加，羰-氨反應產生的吡嗪類物質的種類和產量也增加。羰氨縮合后，糖通過反醇醛、烯醇化和脫水反應進行降解，這些反應都具有堿催化作用。且4個組合均在pH 12.0時抗氧化活性達到最強，鯽魚蛋白-D-木糖最高為40.59%。

2.1.4不同底物質量比對美拉德反應產物抗氧化活性的影響

不同底物質量比對美拉德反應產物抗氧化活性的影響見圖4。

圖4　不同反應底物比例下實際體系MRPs對DPPH自由基清除率的變化Fig.4 The change of different reaction substrate ratio on DPPH radical scavenging activity of actual system MRPs

由圖4可知，底物質量比對實際體系美拉德反應產物抗氧化活性的影響表明，在魚肉蛋白質含量與D-木糖比例小于1范圍內，隨著魚肉含量的增加MRPs抗氧化活性顯著減小；在魚肉蛋白質與D-木糖比例大于1范圍時，隨著魚肉含量的增加MRPs抗氧化活性增加顯著，當魚肉蛋白與D-木糖的比例為3∶1時抗氧化活性達到最高。圖4還表明，在美拉德反應中，底物中糖類與蛋白質質量相接近時，MRPs抗氧化活性最低，固定魚肉含量，隨著D-木糖含量的增加MRPs抗氧化活性緩慢升高。固定D-木糖含量，隨著魚肉蛋白質含量增加MRPs抗氧化活性增加比D-木糖要快，由此可預見，魚肉蛋白相對于D-木糖而言，對實際體系美拉德反應產物的生成更具有關鍵性的作用。

2.2均勻試驗

2.2.1均勻試驗因素水平設計

單因素試驗結果表明鯽魚蛋白-D-木糖組合的美拉德反應產物的抗氧化活性均高于其它3個組合。因此，下一步進行均勻試驗優化鯽魚蛋白-D-木糖組合優化出反應的最佳工藝條件。以DPPH自由基清除率為檢測指標，采用U6*（64）［13］均勻試驗表，因素水平表見表1。

表1　U6 *（64）均勻試驗因素水平表Table 1 Levels and factors of U6*（64）uniform experiment

表2　均勻試驗結果Table 2 Results of uniform experiment

2.2.3軟件分析

采用Mathematics 4. 0軟件對均勻試驗結果進行分析，得到結果見表3、表4。

表3　回歸參數表Table 3 Regression parameter table

表4　回歸方差分析表Table 4 Regression analysis of variance table

Mathematics 4.0軟件分析結果表明，反應初始pH 對MRPs抗氧化活性具有極顯著影響，加熱時間和初始pH之間及加熱溫度和初始pH之間均具有交互作用，并對MRPs抗氧化活性的影響極顯著。影響MRPs抗氧化活性的主次順序依次為：pH（X3）＞時間（X1）＞溫度（X4）＞質量比（X2）。

回歸方程：Y（自由基清除率）=35.721-1.44808X1X30.1+ 97.136 7X30.5-7.955 84×10-6X12X2-0.000 894 773X3X42。在測試條件范圍內，經過計算后的最佳優化條件為：溫度136℃、反應時間70 min、反映初始pH 12. 0、鰱魚蛋白與木糖質量比3∶1，此時MRPs抗氧化活性最強，對DPPH自由基的理論清除率為44.35%。經試驗驗證在此優化條件下得到的MRPs對DPPH自由基的清除率為43.29%，與理論值的相對誤差2.39%，超過各試驗值。說明均勻試驗優化后的最優條件組合制備的MRPs具有最強的抗氧化活性，優化結果可靠。

3　討論與結論

以4種不同品種魚肉（鰱魚、草魚、鯽魚和鯉魚）與D-木糖進行實際體系美拉德反應，通過普通油浴加熱制備不同反應條件下的美拉德反應產物，以DPPH自由基（DPPH·）作為美拉德反應產物抗氧化活性的測定指標，利用單因素試驗、探索加熱溫度、時間、pH及反應底物質量比對美拉德反應的影響，并選出MRPs抗氧化活性最強的魚肉蛋白-D-木糖實際體系組合。由單因素試驗結果可知，實際體系美拉德反應產物的抗氧化能力隨著反應溫度的升高和反應時間的延長而逐漸增強，反應初始pH為12.0時MRPs的抗氧化活性最強，增加反應底物魚蛋白的濃度則有利于提高MRPs的抗氧化能力，且鯽魚蛋白-D-木糖組合對DPPH自由基（DPPH·）清除率最高，MRPs的抗氧化活性最強。對鯽魚蛋白-D-木糖進行均勻試驗優化出最佳工藝條件。結果表明：最佳工藝條件為：反應時間70 min，溫度136℃，初始pH 12.0及反應底物質量比（鯽魚蛋白∶D-木糖）為3∶1。反應初始pH對MRPs抗氧化活性具有極顯著影響，加熱時間和初始pH之間及加熱溫度和初始pH之間均具有交互作用，并對MRPs抗氧化活性的影響極顯著，經由均勻試驗優化反應條件后所制備的美拉德反應產物，其抗氧化能力得到顯著提高，抗氧化能力最強。

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Study on Antioxidant Activities of Maillard Reaction Products Derived from Fish Protein-D-xylose

ZHANG Yin-liang，LU Man-man，ZHANG Lu-yan
（School of Food & Bioengineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450001，Henan，China）

Abstract：The purpose was to optimize the antioxidant activity of Maillard reaction products（MRPs）derived from four different varieties of fish protein silver carp，grass carp，crucian carp，carp and D-xylose actual system，the preparation of reaction producted by constant temperature oil bath heating and DPPH radical-scavenging activity was described as the antioxidant activity indicator.The temperature，retention time，pH and mass ratio were taken into consideration，selecting MRPs strongest antioxidant activity of fish protein-D-xylose actual system combination，the optimize conditions from uniform test. The optimal conditions were retention time 70 min，temperature 136℃，pH 12.0，mass ratio（crucian carp protein∶D-xylose）3∶1.

Key words：maillard reaction；actual system；antioxidant activity；fish；D-xylose

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.009

作者簡介：章銀良（1963—），男（漢），教授，博士，主要研究方向：食品科學與質量安全。

收稿日期：2015-03-10