“對葉大戟”總黃酮的提取及其抗氧化活性研究

再乃普古麗·伊斯馬伊力，外塔尼古麗·卡米力，阿布拉江·克依木（新疆大學化學化工學院，新疆烏魯木齊830046）

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“對葉大戟”總黃酮的提取及其抗氧化活性研究

再乃普古麗·伊斯馬伊力，外塔尼古麗·卡米力，阿布拉江·克依木*（新疆大學化學化工學院，新疆烏魯木齊830046）

摘要：研究“對葉大戟”總黃酮的提取工藝及其體外抗氧化活性。在單因素試驗的基礎上，選定乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度等4個因素對“對葉大戟”總黃酮提取率的影響。選用L9（34）表進行正交試驗，確定從“對葉大戟”中提取黃酮類化合物的最佳工藝條件為乙醇濃度為50%，料液比1∶25（g/mL），提取時間30 min，超聲溫度30℃。在此條件下提取的“對葉大戟”總黃酮含量為3.5%。影響總黃酮提取率所選的因素主次順序為：提取時間（D）＞提取溫度（A）＞料液比（C）＞乙醇濃度（B）。抗氧化性試驗結果表明，對葉大戟總黃酮對羥基自由基、DPPH自由基清除能力。即“對葉大戟”總黃酮的抗氧化活性強于VC。

關鍵詞：對葉大戟；總黃酮；提取工藝；抗氧化

“對葉大戟”（Euphorbia Sororia A）為大戟科大戟屬一年生草本植物，以全草入藥和果實入藥，主要分布于中亞和我國新疆和田等地區［1-2］。該藥材里面含有較多的黃酮類化合物。黃酮類化合物是天然的抗氧化劑，具有清除人體中超氧離子自由基的生理活性，對人類和動物健康有好處，具有抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、抗癌、抗炎等功能［3-4］。“對葉大戟”是維吾爾醫學常用藥材，主治功能為利水消腫、降壓清腦、瀉下雜蟲。用于大便秘結、尿頻、高血壓頭痛、肝硬化、水腫以及疥瘡腫痛等［5］。本文對維藥材“對葉大戟”進行提取及其體外抗氧化活性研究。由于一些人工合成的抗氧化劑發現有毒性，不安全等問題，因此近年來從植物中提取的天然黃酮類化合物已廣泛應用于食品工業，此為天然抗氧化劑具有安全、無毒且具有抗癌、抗衰老和防治心腦血管疾病的作用和無污染等優點已經越來越受到人們的重視。開發新的天然抗氧化劑是食品和醫藥工業的一項重大課題［6］。因此“對葉大戟”中化學成分的提取分離與分析研究，對其開發利用“對葉大戟”具有重要的科學意義和學術價值。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

“對葉大戟”（Euphorbia sororia A）藥材于2011年8月在新疆和田地區采集的，蘆丁（純度為99.99%），乙醇、甲醇、石油醚、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰二氮菲（1，10-菲啰啉）、硫酸亞鐵、過氧化氫、DPPH試劑（1，1-二苯基-2-苦基肼自由基）VC標準品（抗壞血酸）均為國產分析純。

1.2儀器與設備

瑞士R-200 BUCHI旋轉蒸發儀：烏魯木齊市祥生儀器有限公司；VIS-723型分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；KQ5200B型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；WS210S型電子天平：北京賽多利天平有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1標準曲線的繪制

準確稱取在120℃干燥恒重的蘆丁標準品20.0mg，置于100 mL容量瓶中，加70%乙醇溶液溶解，定溶到100 mL，搖勻，配制濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標準品溶液。取蘆丁標準溶液2.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1.0 mL搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉溶液10 .0 mL，再用70%乙醇溶液稀釋至刻度，放置15 min后，在450 nm～800 nm波長范圍內掃描，結果在510nm處有最大吸收峰。分別吸取濃度為0.200 mg/mL的蘆丁標準溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mL，于25 mL容量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min；加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min；再加入4%氫氧化鈉溶液10.0 mL，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置10 min～15 min，以無蘆丁溶液作為空白對照試驗。在510 nm處測得不同濃度下吸光度值，以吸光度值為縱坐標，濃度為橫坐標進行回歸，繪制標準曲線。

其回歸方程為：Y = 12.665x-0.006 4，相關系數R2= 0.999 6。

1.3.2“對葉大戟”中總黃酮的含量測定

準確稱取一定量的“對葉大戟”藥材，用適量的50%乙醇超聲提取30 min，抽濾，減壓濃縮回收乙醇，將濃縮物用50%乙醇溶解，搖勻，定容50 mL容量瓶中。取此樣品液2 mL置于25 mL容量瓶中，然后在510 nm處按1.3.1的方法測定樣品的吸光度Y，將吸光度值帶入標準曲線的回歸方程得到樣品溶液濃度，用下面計算公式計算（超聲波輔助提取法）的“對葉大戟”樣品中總黃酮含量。原料中總黃酮含量計算公式：

式中：c為測定出來的濃度，mg/mL；v為樣品溶液的總體積，mL；n為稀釋陪數；m為樣品質量，g。

1.3.3“對葉大戟”黃酮的提取

1.3.3.1乙醇濃度對“對葉大戟”總黃酮提取率的影響

稱取1.0g粉末狀“對葉大戟”5份，分別加入20mL 的50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，提取溫度為30℃，在超聲波輔助條件下提取30 min，抽濾，減壓濃縮回收乙醇，定容于50 mL容量瓶中，并確定吸光度值。

1.3.3.2提取時間對“對葉大戟”總黃酮提取率的影響

稱取1.0g粉末狀“對葉大戟”5份，分別加入20mL 60%乙醇溶液，提取溫度30℃，在超聲波輔助條件下分別浸泡15、30、45、60、75 min，抽濾，減壓濃縮回收乙醇，定容于50 mL容量瓶中，并確定吸光度值。

1.3.3.3料液比對“對葉大戟”總黃酮提取率的影響

稱取1.0 g粉末狀“對葉大戟”5份，分別加入10、15、20、25、30 mL 60%乙醇溶液，提取溫度為30℃，提取時間為45 min，抽濾，減壓濃縮回收乙醇，定容于50 mL容量瓶中，并確定吸光度值，考察料液比對提取效果的影響。

1.3.3.4提取溫度對“葉大戟總”黃酮提取率的影響

稱取粉末狀1.0 g“對葉大戟”5份，分別加入20 mL 60%乙醇溶液，提取溫度分別為30、35、40、45、50℃，提取時間為45 min，減壓濃縮回收乙醇，定溶于50 mL容量瓶中，并確定吸光度值，考察提取溫度對提取效果的影響。

1.3.4正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，分別研究料液比，乙醇濃度，提取時間，提取溫度對"對葉大戟"中黃酮提取的影響，做四因素三水平正交試驗設計，優化對葉大戟中黃酮的提取工藝。因素水平見表1。

表1　正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.5體外抗氧化活性的檢測

1.3.5.1清除羥自由基（·OH）能力的測定

參照文獻［7］的方法，在10 mL具塞容量瓶中，加入1.50 mL 5 mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液和2.0 mL 0.2 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液4.0 mL，充分混勻，再加入1.0 mL 7.5 mmol/L硫酸亞鐵溶液，立即混勻后加入1.0 mL 1%過氧化氫溶液啟動反應，于37℃水浴中60 min保溫，于536 nm處測定吸光度A1。用1.0 mL蒸餾水代替過氧化氫溶液及測定吸光度A2。用樣品液1.0 mL代替1.0 mL蒸餾水測定吸光度A3。VC做陽性對照。計算公式為：

1.3.5.2清除DPPH自由基能力的測定

參照文獻［8］的方法，分別吸取樣品溶液2.0 mL，加入0.04 mg/mL DPPH乙醇溶液2.0 mL，反應20 min后，于517 nm處測定吸光度Ai。同時，測定2.0 mL樣品溶液與2.0 mL乙醇混合液在517 nm處測定吸光度Aj，再測定2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL乙醇溶液在517 nm處測定的吸光度Ao。每處理重復3次。VC做陽性對照。計算樣品溶液對DPPH自由基的清除率：

DPPH自由基清除率/%=［1-（Ai-Aj）/Ao］×100

式中：Ao為DPPH溶液與乙醇溶液的吸光度；Ai為加入樣品后的DPPH溶液的吸光度；Aj為樣品溶液與乙醇溶液的吸光度。

1.3.5.3總抗氧化力測定

參照文獻［9］的方法取某一濃度的樣品溶液1.0mL，分別加入pH6.6的磷酸鹽緩沖液2.5 mL和1%K3Fe（CN）6溶液2.5 mL，混合后在50℃水浴中反應20 min后迅速冷卻，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL混合，取混合液2.5mL，加入2.5mL蒸餾水和0.1%FeCl3溶液2.5mL，充分混勻，靜置10 min后于700 nm處測定吸光度A。VC做陽性對照。以A700代表還原力強度，A越大，還原力越大。

2　結果與討論

2.1標準曲線的繪制

按前述方法1.3.1，在510 nm處測定不同濃度的蘆丁標準溶液的吸光度值，以吸光度A為縱坐標，蘆丁濃度為橫坐標繪制標準曲線見圖1。由圖1可知，當標準品含量為0.03 mg/mL～0.04 mg/mL時與吸光度值有良好的線性關系。

圖1　蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2單因素試驗

2.2.1乙醇濃度對“對葉大戟”總黃酮提取率的影響

按前述方法1.3.3.1，乙醇濃度對“對葉大戟”總黃酮提取率的影響測定結果由見圖2。

圖2　乙醇濃度對“對葉大戟”黃酮提取率的影響Fig．2 Effects of ethanol concentration on the extraction yield of total flavoniods

由圖2可以看出，當乙醇濃度達到60%時，黃酮類化合物溶解度最大，吸光度最高。乙醇濃度再增加，黃酮類化合物溶解度減小，同時一些醇溶性雜質、色素、親脂性強的成分溶出量增加，這些成分與黃酮類化合物競爭同乙醇水分子結合，從而導致黃酮化合物提取率下降。因此，本試驗60%乙醇選為提取溶劑。

2.2.2提取時間對“對葉大戟”總黃酮提取率的影響

按前述方法1.3.3.2，提取時間對“對葉大戟”總黃酮提取率的影響測定結果見圖3。

圖3　提取時間對“對葉大戟”黃酮提取率的影響Fig．3 Effects of extraction times on the yield of total flavonoids

從圖3可以看出，隨著時間的延長，黃酮類化合物的提取率逐漸增加，在提取時間為15 min～30 min內的提取率變化最大，提取時間為30 min后影響不大，吸光度值基本保持穩定，提取率趨于平緩。如果提取時間過短，因黃酮類化合物沒有完全提取而提取效率低，提取時間過長，會導致黃酮類化合物被氧化而破壞，造成提取率還是降低，同時，不利于生產周期，會增加生產成本和消耗，因此選45 min為最佳提取時間。

2.2.3料液比對“對葉大戟”總黃酮提取率的影響

按前述方法1.3.3.3，料液比對“對葉大戟”總黃酮提取率的影響測定結果見圖4。

圖4　料液比對“對葉大戟”總黃酮提取率的影響Fig．4 Effects of solid-liquid ratio on the yield of flavonoids

從圖4可以看出，隨著料液比的增大，先提取總黃酮量逐漸增大，當料液比為1∶20（g/mL）時吸光度最大就提取效率好，而后隨著料液比繼續增加，提取量則有下降。適量的溶劑量有利于黃酮類化合物的提取效率，料液比過低時，會導致提取溶劑的飽和現象就不利于黃酮類化合物的提取效率，料液比過大，溶劑消耗量太多，會給后續的濃縮工作增加困難。因此，從提取效率和實驗成本的角度來考慮，選擇料液比1∶20（g/mL）為宜。

2.2.4溫度對“對葉大戟”總黃酮提取率的影響

按前述1.3.3.4方法，溫度對“對葉大戟”總黃酮提取率的影響測定結果見圖5。

圖5　提取溫度對“對葉大戟”總黃酮提取率的影響Fig．5 Effects of extraction temperature on the yield of total flavonoids

從圖5可以看出，隨溫度的升高，先黃酮類化合物的吸光度升高而后隨著溫度的升高降低。當溫度35℃時吸光度最大，而超過35℃時吸光度開始下降，提取量則減少，達到40℃～50℃時吸光度變化不大，提取率保持不變。主要原因是由于溫度過高時，活性成分容易破壞而提取率下降。考慮黃酮類化合物的熱穩定性和提取溶劑的揮發性問題，故35℃可作為最佳提取溫度。

2.3正交試驗設計及結果

根據正交試驗設計以料液比、乙醇濃度、提取時間、提取溫度為單因素，對“對葉大戟”中總黃酮類化合物進行提取，按1.3.1標準曲線的測定方法測定提取液的吸光度。以測得的“對葉大戟”中黃酮類物質提取量為考察指標，選用L9（34）正交試驗。確定“對葉大戟”總黃酮的最佳提取工藝條件。試驗結果如

表2　所示。表2正交試驗設計與結果Table 2 Design and results of orthogonal test

由表2可知，影響“對葉大戟”中總黃酮提取率的因素主次順序為：提取時間（D）＞提取溫度（A）＞料液比（C）＞乙醇濃度（B）。由表2可以看出，提取時間對實驗的影響最為顯著。各種因素的最優組合為A1B3C2D1，即乙醇濃度為50%，料液比1∶25（g/mL），提取時間30 min，超聲溫度30℃。在此條件下提取的“對葉大戟”黃酮含量為3.5%。

2.4體外抗氧化活性檢測結果

2.4.1總黃酮和VC對羥基自由基（·OH）的清除作用

按前述1.3.5.1方法，總黃酮和VC對羥基自由基（·OH）的清除作用測定結果見圖6。

圖6　樣品和VC的羥基自由基清除曲線Fig．6 The scavenging effect of sample and Vc on hydroxyl radical

由圖6可以看出，VC標準品溶液和“對葉大戟”總黃酮提取液在Fenton體系中對羥基自由基均有清除作用，并都隨樣品濃度的增加而增強。VC和總黃酮對羥基自由基的清除率呈現一定量效正相關關系，且隨著樣品濃度的增加清除能力增強。當樣品濃度0.45mg/mL時，VC和總黃酮的清除率分別達到64.55%、84.77%。試驗結果表明總黃酮的清除作用大于VC的清除作用，說明“對葉大戟”總黃酮對羥基自由基具有很強的清除作用。

2.4.2總黃酮和VC對DPPH自由基的清除作用

按前述方法1.3.5.2，總黃酮和VC對DPPH自由基的清除作用測定結果見圖7。

圖7　樣品和VC的DPPH自由基清除曲線Fig．7 The scavenging effect of sample and VCon DPPH free radical

由圖7可以看出，VC標準品溶液和“對葉大戟”總黃酮提取液對DPPH自由基有一定量的清除作用，且隨樣品濃度的增加清除能力增強。當樣品濃度20 μg/mL時，VC和總黃酮的清除率分別達到82.45%、95.76%。故總黃酮的清除率大于VC，說明“對葉大戟”總黃酮對DPPH自由基具有很強的清除作用。

2.4.3總黃酮和VC的還原力

按前述方法1.3.5.3，總黃酮和VC的還原力測定結果見圖8。

圖8　樣品和VC的還原力曲線Fig．8 The reduction oxidation of sample and VC

由圖8可以看出，當樣品濃度0.25 mg/mL時，VC和總黃酮的吸光度分別為1.202、1.129。VC和“對葉大戟”總黃酮的還原力與樣品的濃度成正關系，并隨著樣品濃度的增加呈現逐漸增強的趨勢，說明“對葉大戟”總黃酮表現出較強的還原能力。

3　結論

1）以“對葉大戟”為研究對象，研究提取該藥材中總黃酮的最佳工藝條件。在單因素試驗的基礎上，選定乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度等4個因素的3個水平進行正交試驗。正交試驗結果顯示，最佳提取條件為A1B3C2D1，即乙醇濃度為50%、料液比1∶25（g/mL）、提取時間30 min、超聲溫度30℃。在此條件下“對葉大戟”黃酮含量為3.5%。本研究采用超聲波法輔助提取“對葉大戟”中的總黃酮，用分光光度法測定“對葉大戟”總黃酮含量，方法簡便、快速、穩定、提取效率高。正交試驗法用于提取工藝優化減少了試驗次數、節約了試驗成本、這是天然產物有效成分提取工藝優化實驗很好的工具，通過正交試驗確定了“對葉大戟”中總黃酮的最佳提取工藝條件。這表明“對葉大戟”中含有豐富的黃酮類化合物。這一工藝條件的獲得對“對葉大戟”黃酮的提取研究具有一定的參考價值，并為進一步開發“對葉大戟”植物資源提供了一定的理論參考。

2）通過“對葉大戟”總黃酮提取液對羥基自由基和DPPH自由基的清除作用、還原能力的測定可以發現，“對葉大戟”中總黃酮提取液表現出很強的羥基自由基和DPPH自由基的清除率，較高的還原能力，具有良好的體外抗氧化作用，有作為天然抗氧化劑進一步開發利用的價值。

試驗結果表明，羥基自由基清除能力測定法和DPPH自由基清除能力測定法中樣品具有很強的抗氧化活性，既總黃酮的抗氧化活性強于VC；而在還原能力測定法中VC的抗氧化能力強于總黃酮。研究結果為“對葉大戟”黃酮類成分的進一步分離總黃酮及抗氧化活性的開發利用具有重要的指導意義。

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Study on the Extraction of Total Flavonoids from Euphorbia Sororia A and It's Antioxidant Activities

Zeynepgul ESMAYIL，Wetengul KAMIL，Ablajan KEYUME*
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Xinjiang University，Urumqi 830046，Xinjiang，China）

Abstract：The extraction conditions and antioxidant activities of total flavonoids from Euphorbia Sororia A were investigated. The effects of four factors on the extraction，included ethanol concentration，material/ solvent ratio，extraction time，extraction temperature by single factor test. Table L9（34）was used to conduct the orthogonal experiment，the optimum conditions for extracting total flavonoids from Euphorbia Sororia A were：ethanol concentration 50%，material/ solvent ratio 1∶25（g/mL），extraction time 30 min，extraction temperature 30℃. Under these optimum conditions，extraction rate of total flavonoids was 3.5%. Extraction time had the most important effect on extraction，followed by extraction temperature，material/ solvent ratio，ethanol concentration. The results of antioxidation showed that from Euphorbia Sororia A had a certain scavenging activity on OH and DPPH radicals，we found the total flavonoids from Euphorbia Sororia A had stronger antioxidative activity than VC.

Key words：Euphorbia sororia A；total flavonoids；extraction conditions；antioxidation

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.030

基金項目：西部之光人才培養基金項目資助

作者簡介：再乃普古麗·伊斯馬伊力（1989—），女（維吾爾），碩士研究生，主要從事天然產物的化學成分及其活性研究

*通信作者：阿布拉江·克依木（1976—），男，教授，碩士生導師，研究方向：中藥及維吾爾藥化學成分及其活性研究。

收稿日期：2015-03-10