利用鄰位連接技術(shù)檢測花生過敏原成分

張霞，趙良娟，高琳，溫華蔚，王飛雪，董焱，劉掘茫，劉寅，鄭文杰，*（.天津出入境檢驗檢疫局，天津30046；.南開大學，天津30007）

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利用鄰位連接技術(shù)檢測花生過敏原成分

張霞1，趙良娟1，高琳1，溫華蔚1，王飛雪2，董焱2，劉掘茫1，劉寅2，鄭文杰1，*
（1.天津出入境檢驗檢疫局，天津300461；2.南開大學，天津300071）

摘要：建立一種新型花生過敏原成分的快速篩選檢測方法--鄰位連接技術(shù)檢測方法。針對花生過敏原選擇適當?shù)氖笤磫慰寺】贵w，并合成針對花生過敏原的兔源多克隆抗體然后與磁顆粒偶聯(lián)，而后將羊抗兔二抗與一條DNA分子耦聯(lián)制成親和探針1，將另一條寡核苷酸序列與羊抗鼠二抗耦聯(lián)制成親和探針2，上述成分能夠與一連結(jié)DNA組合成鄰位連接復合物，建立鄰位連接檢測花生過敏原的方法。使用3種花生過敏原標準品和10種確定不含花生過敏原的樣本進行特異性試驗；通過稀釋花生過敏原標準品進行靈敏度驗證。建立方法具有很好的特異性；檢測標準品的靈敏度為0.01 ng/mL，比普通ELISA試劑盒靈敏度提高了1 000倍。建立的鄰位連接檢測花生過敏原的方法能夠檢測出使用目前常規(guī)方法不能檢測到的花生過敏原，具有重要的實際意義。

關(guān)鍵詞：花生過敏原；鄰位連接；親和探針；磁顆粒

食物過敏目前已被認為是嚴重的公共衛(wèi)生問題。根據(jù)美國FDA資料統(tǒng)計，在美國，2%的成年人和5%的嬰幼兒患有食物過敏癥，每年大約30 000人需要臨床緊急治療，2 000人住院，150人死于食物引起的過敏反應［1-2］。據(jù)有關(guān)報告，我國的發(fā)病率高于發(fā)達國家［3］。我國和國際對花生導致過敏性休克和過敏性死亡的病例報道十分常見。食入含量甚微的花生過敏原食物就可能對高度敏感的患者引發(fā)過敏反應，如腸胃不適、過敏性皮炎等疾病，嚴重者甚至會發(fā)生過敏性休克和過敏性死亡［4］。臨床資料和調(diào)查顯示，食物過敏癥近年成上升趨勢，甚至是成倍增長。因此對花生中過敏原的檢測就顯得尤為重要。

現(xiàn)階段對過敏原的檢測主要有色譜技術(shù)、免疫分析技術(shù)、生物傳感技術(shù)及分子生物學技術(shù)［5-10］等，但是有的靈敏度有一定的限制，有的針對過敏原成分進行檢測，并不是針對可致敏的蛋白進行，而食品安全性的檢測不但需要極高的靈敏度，而且如果可以有針對性地對過敏蛋白進行目標檢測，對指導醫(yī)生臨床治療及人民日常生活消費，具有重要的意義。

鄰位連接技術(shù)（Proximity Ligation Assay，PLA）是基于酶連機制和掛鎖探針（一種人工設(shè)計的線狀寡核苷酸單鏈，其兩端可以與特定靶序列互補。當掛鎖兩端的靶序列雜交時，在空間上就會彼此靠近，探針的兩個末端就可以在DNA連接酶的作用下連接成鏈）而建立的一種高靈敏度的蛋白質(zhì)體外分析技術(shù)［11-12］。該方法首先利用一對鄰位探針對靶分子進行雙識別，產(chǎn)生可擴增的檢測信號，再通過定量PCR實現(xiàn)定時定量檢測，將對蛋白質(zhì)的檢測轉(zhuǎn)化為對DNA的檢測，具有極高的靈敏性和特異性。

1　材料與方法

1.1主要材料與試劑

鼠源花生過敏原單克隆抗體、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗：購自Abcam公司；兔源花生過敏原多克隆抗體：由金標抗體公司合成；50 nm磁顆粒：購自西安金磁生物科技有限公司；花生過敏原標準品、花生過敏原ELISA檢測試劑盒、SYBR Green實時熒光PCR檢測試劑盒：購自ABI公司。

1.2主要儀器與設(shè)備

熒光PCR檢測儀：ABI，Step one；離心機：Eppendorf，R12；DNA/RNA/蛋白分析儀：BioDrop，plus。

1.3方法

1.3.1親和探針的制備

利用Primer Primer軟件設(shè)計兩條DNA單鏈（Nt1 和Nt2）以及一條連接序列（連接DNA），該序列能夠和Nt1序列以及Nt2序列在不同位置互補，且互補后形成的雙鏈，使得Nt1的3’端和Nt2的5’端相鄰；且能夠在核酸連接酶的作用下連接成一條DNA分子。

將Nt1的5’端用生物素進行標記；將游離的鏈霉親和素（STV）與Nt1按摩爾比1∶1的比例混合，室溫震蕩1 h；將羊抗兔二抗重鏈非可變區(qū)進行生物素標記；將生物素標記二抗和標記好步驟（2）的產(chǎn)物和步驟（4）的產(chǎn)物按摩爾比4∶1的比例混合后，室溫震蕩1 h，形成親和探針1。

將Nt2的5’端用生物素進行標記；將游離的鏈霉親和素（STV）與Nt2按摩爾比1∶1的比例混合，室溫震蕩1 h；將羊抗鼠二抗重鏈非可變區(qū)進行生物素標記；將步驟（1）的產(chǎn)物和步驟（3）的產(chǎn)物按摩爾比4∶1的比例混合后，室溫震蕩1 h，形成親和探針2。

Nt1的序列為5’-Biotin-GAC GAC TGC TGA CGG GCT ACT AGG TGA CGA ACC GCT TTG CCT GAA GTA TCA ACG ACA GTC-3’；Nt2的序列為5’-AAT AGC AGG GGT ACC TAC CGA GCA AAA CGC TGG GCT GCA TCA GTC GGG TCT TCG TCC ACG-Biotin-3’；連接DNA的序列為5’-TTT TAC CCC TGC TAT TGA CTG TCG TTG ATC CC-3'。

1.3.2磁顆粒兔源IgG復合物的制備

磁顆粒兔源IgG復合物的根據(jù)西安金磁生物技術(shù)有限公司的試劑盒說明書操作，簡述如下。取200 μL兔源抗花生過敏原IgG抗體（1 mg/mL）與200 μL耦聯(lián)緩沖液混合，制備抗體溶液；取2.0 mL的離心管加入200 μL納米金磁顆粒溶液和400 μL耦聯(lián)緩沖液，輕搖混勻，磁性分離2 min，棄上清；取300 μL抗體溶液加入含有上述混合液的離心管中，置于恒溫搖床上，37℃、180 r/min振蕩反應20 min，磁性分離，棄上清；沉淀物用300 μL清洗緩沖液清洗兩次；然后用1×PBS緩沖液300 μL平衡；取一支封閉劑加入1×PBS緩沖液1 mL，充分混合溶解，磁顆粒復合物中，輕搖混勻后，置于恒溫搖床上，37℃、180 r/min振蕩反應1 h，封閉磁顆粒，封閉后磁性分離，棄上清；向封閉后的磁顆粒中加入1×PBST緩沖液800 μL清洗3次；最后加入保存緩沖液1 mL，輕搖混勻，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3鄰位連接復合物的生成

將親和探針1按摩爾比4∶1加入到耦聯(lián)兔源抗花生過敏原蛋白IgG的納米金磁顆粒溶液中，充分混勻，置于37℃水浴鍋中反應2 h，取出用清洗緩沖液清洗3次，得到檢測液1；將親和探針2按摩爾比4∶1加入到鼠源抗花生過敏原蛋白IgG中充分混勻，置于37℃水浴鍋中反應2 h，得到檢測液2；將100 μL待測樣本與檢測液1和2各100 μL混合，充分混勻，靜置數(shù)分鐘，置于磁力架上，清洗3次。此時加入連接DNA，如果待測液中含有能夠被抗體識別的花生過敏原成分則能夠形成鄰位連接復合物如圖1所示。

圖1　鄰位連接復合物示意圖Fig.1 The Compound of PLA

1.3.4DNA連接

按與兩種親和探針摩爾比為1∶1的量加入連接DNA后，加入T4連接酶（NEB公司）并根據(jù)說明書加入dNTPs、緩沖液、ddH2O等置于16℃水浴鍋中進行連接20 min，連接結(jié)束后再次清洗。

1.3.5連接后DNA雙鏈的檢測

取5μL DNA連接產(chǎn)物加入1 μL，20 μmol/L PCR引物，該引物能夠擴增Nt1和Nt2連接后的DNA序列。引物序列如下：前引物5’-CGA CTG CTG ACG GGC TAC-3’；后引物5’-AGC GTT TTG CTC GGT AGG-3’。將上述混合物共7 μL與12.5 μL，2倍實時熒光SYBR Green PCR buffer和4.5 μL ddH2O混合，按照下面程序進行熒光定量PCR檢測。94℃60 s預變性，而后進行45個循環(huán)，每個循環(huán)由以下3步進行94℃10 s，55℃10 s，72℃10 s。

1.3.6特異性試驗

分別取1 μL花生過敏原標準品稀釋1000倍、而后取1 μL榛仁過敏原標準品和杏仁過敏原標準品（均取自ELISA試劑盒）按照反應體系進行試驗，評估本方法的特異性。

1.3.7靈敏度試驗

取1μL 10 ng/mL的花生過敏原標準品，進行10倍稀釋，按照反應體系進行試驗，試驗重復6次檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1特異性試驗

特異性試驗見圖2。

圖2　花生過敏原PLA試劑特異性檢測結(jié)果Fig.2 Specificity of detecting peanut allergen

檢測3種食品過敏原，其中花生過敏原均為陽性，Ct值（Cycle threshold，循環(huán)閾值）＜30，而其他樣本均為陰性，Ct值＞30，如圖2所示，1-9號為花生過敏原標準品稀釋液的檢測結(jié)果，其中過敏原標準品來自于市售的ELISA試劑盒中的陽性參考品，1-3號為R-Biopharm RIDASCREEN FAST peanut R-6202的3次重復試驗結(jié)果，4-6號為Bio-check（UK）Peanut ELISA Kit R6021的3次重復試驗結(jié)果，7-9號為Bio-Front Mono Trace BF1066的3次重復試驗結(jié)果；10-15號為其他過敏原試劑盒的陽性參考物質(zhì)，其中10-12號為Biocheck（UK）Almond ELISA Kit R6019中杏仁過敏原陽性參考品的3次重復試驗結(jié)果；13-15為Bio-check （UK）Hazelnut ELISA Kit R6015中榛仁過敏原陽性參考品的3次重復試驗結(jié)果。結(jié)果說明該方法特異性良好，而且對于花生過敏原具有很好的通用性。

2.2靈敏度試驗

1 μL 10 ng/mL的花生過敏原標準品，進行10倍稀釋，稀釋至10-5，按照反應體系進行試驗，試驗重復6次，結(jié)果見表1。

表1　花生過敏原PLA試劑靈敏度檢測結(jié)果（Ct值）Table 1 Sensitivity of detecting peanut allergen

根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，可見在0.01 ng/mL的濃度下（已經(jīng)高于市售ELISA試劑盒靈敏度100倍）靈敏度檢測所得到的Ct值全部低于30，而在0.001 ng/mL的濃度下，得到的Ct值則在28.5～31.4之間，在0.000 1 ng/mL的濃度下得到的結(jié)果則在31.7以上且出現(xiàn)類似于陰性參考品的曲線，即表中的NA結(jié)果。因此我們認為：（1）檢測靈敏度不能達到0.0001ng/mL；（2）由于0.001 ng/mL 時Ct值的最大值（31.4）已經(jīng)很接近0.000 1 ng/mL時Ct值的最小值（31.7），在該濃度范圍內(nèi)不能實現(xiàn)定量檢測，而且擴增結(jié)果具有一定的隨機性，本著謹慎性的原則我們同樣認為檢測靈敏度不能達到0.001 ng/mL；（3）將檢測靈敏度定為0.01 ng/mL后，根據(jù)表中的數(shù)據(jù)得到此時的Ct值在25.3～27.9之間，所以選擇大于最大值（27.9）的整數(shù)30，作為檢測靈敏度為0.01 ng/mL時的陽性參考值，Ct值＜30時為陽性（標注為+），Ct值＞30及NA為陰性（標注為-）。

3　結(jié)論

與傳統(tǒng)檢測手段相比，PLA方法具有檢測靈敏度高的特點，能夠更可靠發(fā)現(xiàn)低含量的食品中的過敏原。本研究建立的鄰位連接檢測花生過敏原的方法特異性好、靈敏度高，能夠檢測出使用目前常規(guī)方法不能檢測到的花生過敏原，具有重要的實際意義。

鄰位連接技術(shù)是近十年來發(fā)展起來的新型檢測技術(shù)，該方法的核心技術(shù)路線是以PCR的幾何級數(shù)擴增放大免疫檢測的信號，可以達到很高的靈敏度，但是該技術(shù)的檢測試劑成分較多，方法較為復雜，還不是很適合在基層實驗室推廣。本研究將鄰位連接技術(shù)應用于花生過敏原檢測，屬于前沿性應用研究，隨著該技術(shù)的發(fā)展，可以將親和探針等成分固化，簡化反應步驟，在保證高靈敏度的前提下，提高檢測效率，拓展其應用空間。

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A Proximity Ligation Assay of Peanut Allergen

ZHANG Xia1，ZHAO Liang-juan1，GAO Lin1，WEN Hua-wei1，WANG Fei-xue2，DONG Yan2，LIU Jue-mang2，LIU Yin2，ZHENG Wen-jie1，*
（1. Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China；2．Nankai University，Tianjin 300071，China）

Abstract：To establish a new method with high-sensitivity for detection of peanut allergen-proximity ligation assay. The proximity ligation assay compound consists of monoclonal antibody from mouse to peanut allergen，polyclonal antibody from rabbit to peanut allergen，secondary antibody goat anti-mouse，secondary antibody goat anti- rabbit，DNA nucleotide probe 1 and 2，DNA connector. Three kinds of peanut allergen reference standards and ten samples without peanut allergen including hazelnut and apricot seed references were evaluated the specificity of the proximity ligation assay. The dilution of the peanut allergen reference standards were used to evaluate the sensitivity of the assay. The assay established in present study was highly specific and sensitive. The limit of detection was 0.01 ng/mL for the peanut allergen reference standards，which was 1 000 times better than the ELISA method. The method can detect the invisible peanut allergen objects using traditional methods. It is very useful for detection of peanut allergen in the actual detection work.

Key words：peanut allergen；proximity ligation assay；affinity probe；magnetic particles

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.034

基金項目：質(zhì)檢總局科研專項《鄰位連接技術(shù)高效檢測食品中過敏原蛋白方法的研究》資助（2014IK093）

作者簡介：張霞（1975—），女（漢），高級工程師，碩士研究生，研究方向：食品安全檢測。

*通信作者：鄭文杰（1969—），女，研究員，研究方向：食品安全檢測。

收稿日期：2015-09-01