三個綿羊群體MC4R基因多態性及生物信息學分析

劉嬌嬌馬友記

（1. 甘肅農業大學 動物科學技術學院，蘭州 730070；2. 甘肅省肉羊繁育生物技術工程實驗室，民勤 733300）

三個綿羊群體MC4R基因多態性及生物信息學分析

劉嬌嬌1，2馬友記1，2

（1. 甘肅農業大學 動物科學技術學院，蘭州 730070；2. 甘肅省肉羊繁育生物技術工程實驗室，民勤 733300）

旨在探討綿羊黑素皮質素受體-4（melanocortin-4 receptor，MC4R）的分子機理，采用PCR-SSCP方法對3個綿羊群體（甘肅肉用綿羊新品種群、小尾寒羊和湖羊）的MC4R基因外顯子進行多態性檢測和生物信息學分析。結果表明，3個綿羊群體均存在3種基因型AA型、AB型和BB型，優勢基因型為BB，其中優勢等位基因為B；測序結果表明，野生型BB型和突變型AB型相比，AB型個體在該基因編碼區第511位點發生G→A突變，第495位發生C→T突變；AA型個體在該基因編碼區第511位點發生G→A突變，出現AA的純合，第495位發生C→T突變，出現CC純合；3個綿羊群體中小尾寒羊的多態信息含量屬于中度多態（0.25

綿羊；黑素皮質素受體-4；多態性；生物信息學

MC4R（Melanocortin-4 receptor）是下丘腦腹內側核（VMH）分泌的一種肽類物質，它是G蛋白偶聯受體（G protein coupled receptors，GPCRs）超家族的一個成員，在人和鼠的體重、能量穩態和采食量的調控中具有重要作用［1］。MC4R在哺乳動物中，具有介導瘦蛋白（Leptin）的功能，是一個調節能量動態平衡的重要信號分子［2］。MC4R是第一個被發現的與人類顯性遺傳疾病性肥胖相關的靶位點［3］。鼠和人遺傳學研究顯示MC4R基因在采食量和能量平衡調控中具有重要作用，缺乏MC4R基因的鼠易多食、肥胖，說明MC4R基因在采食量和能量平衡調控中具有重要作用［4，5］。MC4R 在哺乳動物下丘腦、丘腦、胎盤、十二指腸、腦干、脊索、胰腺、胃，雞腎上腺、性腺、脾、脂肪和腦等組織均有表達，具有多種生物學活性。在貉子［6］、豬［7，8］、牛［9］、雞［10］中，MC4R基因突變已經被確定為生長性狀的遺傳標記。甘肅肉用綿羊新品種選育群是利用杜泊、無角陶賽特等引入品種為父本，小尾寒羊和蒙古羊為母本，采用復雜育成雜交培育出的生長發育快、抗病力強、繁殖力高的適應甘肅河西走廊生態條件的肉用綿羊新品種群；湖羊是原產于太湖流域的高繁殖力品種，目前已引入到甘肅肉用綿羊新品種選育群的核心育種區域且表現出良好的適應性。本研究在分析MC4R基因在小尾寒羊、湖羊和甘肅肉用綿羊新品種群中的多態性的基礎上，應用生物信息軟件對其生物信息學分子特征進行分析，以期為下一步的育種工作提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血樣采集 小尾寒羊（134只）、湖羊（120只）和甘肅肉用綿羊新品種群羊（134只）均來自甘肅永昌肉用種羊場，頸靜脈采血10 mL，ACD 抗凝劑，-20℃冰箱保存備用。

1.1.2 主要試劑 所需要的試劑主要有：蛋白酶K、PCR mix酶，6×Buffer、PCR產物回收試劑盒、瓊脂糖、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨等。采用西班牙的瓊脂糖，來自于百泰克的PCR mix酶。

1.2 方法

1.2.1 血液基因組DNA的提取及檢測 采用傳統的酚氯仿法提取基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 引物 參考MC4R基因序列（GenBank登錄號：JQ710684）設計引物，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。序列及相應的摸索條件見表1。

表1MC4R外顯子引物序列、摸索條件及PCR產物大小和位置

1.2.3 PCR擴增 PCR反應體系：25 μL，其中模板基因組DNA 1.0 μL，上下游引物各1.0 μL（10 pmol/μL），PCR mix酶12 μL，水10 μL。PCR反應程序：94℃ 4 min；94℃ 45 s，61.2℃ 45 s，72℃ 1 min。PCR 產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以確認擴增效果。

1.2.4 SSCP分析 將3 μL PCR產物和7 μL變性劑（98%甲酰胺、0.025%溴酚藍、0.025%二甲苯氰、10 mmol/L EDTA）混勻，98℃變性10 min，立即冰浴10 min變性，變性后的PCR產物在12%非變性聚丙烯酰胺Acr∶bis（29∶1）凝膠中在常溫環境下電泳，250 V 電壓10 min 后，改為160 V 電壓8 h。電泳結束后用硝酸銀染色，顯色后，用去離子水洗2遍。

1.2.5 測序 對目的PCR產物中的目的條帶用回收試劑盒進行回收，檢測純度，送到上海生工生物工程（上海）有限公司進行測序。

1.2.6 數據統計與分析 利用DNAman和Bioeditor軟件進行測序結果分析；使用Popgene Version 32生物軟件計算等位基因頻率、基因型頻率、群體純和度（Ho）、群體雜合度（He）、有效等位基因數（Ne），并檢驗是否處于Hardy-Weinberg平衡；利用PIC軟件計算多態信息含量（PIC）值；利用SAS 8.0軟件進行顯著性分析；利用NCBI中的ORF find 確定尋找了MC4R的編碼區，并進行氨基酸的翻譯，利用BLAST對突變位點編碼的氨基酸序列進行比對，采用NetPhos 2.0 Server在線分析程序預測蛋白質的磷酸化位點，采用Interpro在線分析軟件預測蛋白質中包含的結構域，采用PredictProtein在線預測蛋白質的二、三級結構。

圖1 MC4R基因外顯子PCR擴增產物的SSCP分析

2 結果

2.1 MC4R基因PCR-SSCP結果

對擴增產物進行SSCP分析，結果（圖1）顯示出現3種基因型，分別為BB、AB和AA型。

2.2 測序結果

測序結果發現BB型和AB型相比，AB型個體在該基因編碼區第511位點發生G→A的突變，出現G/A的雜合，第495位發生C→T的突變，出現C/T雜合；AA型個體在該基因編碼區第511位點發生G→A的突變，出現AA的純合，第495位發生C→T的突變，出現CC純合。第495位的C→T轉換并沒有引起對應密碼子翻譯的氨基酸發生改變，由AGC變為AGT，均翻譯成絲氨酸（Ser）；第511位的C→T轉換后密碼子由GAA→AAA，翻譯的氨基酸由谷氨酸（Glu）轉換為賴氨酸（Lys）。

2.3 MC4R基因外顯子的群體遺傳學分析

通過對3個綿羊品種共388個樣本SSCP檢測結果（表2）進行分析發現，甘肅肉用新品種群羊、小尾寒羊和湖羊的優勢基因型均為BB型，優勢等位基因均為B基因。群體純和度（Ho）、雜合度（He）、有效等位基因數（Ne）和多態信息含量（PIC）是評價群體內遺傳多樣性的指標，小尾寒羊屬于中度多態（0.250.05）。

表2 基因型和基因型頻率

表3 遺傳多態性分析

2.4 不同基因型在3個綿羊群體中分布的差異顯著性檢驗

采用SAS 8.0軟件對MC4R基因外顯子不同基因型在3個綿羊群體中的分布差異進行顯著性檢驗，結果（表4）表明，甘肅肉用新品種群羊、小尾寒羊和湖羊3個品種的綿羊之間分布差異均不顯著（P>0.05）。

表4 3個綿羊群體在MC4R基因外顯子中分布的獨立性檢驗

2.5 MC4R基因的生物信息學分析結果

2.5.1 MC4R基因編碼蛋白的理化性質 MC4R基因編碼蛋白的基本理化性質，用Protparam工具進行在線預測。預測結果表明，該蛋白分子式為C1666H2621N413O456S26，其理論等電點為7.09，分子量為3.0472 kD。該蛋白共包含20種基本氨基酸，Leu含量最高，占11.4%，其中Trp含量最低，為0.9%。該蛋白共含有17個負電荷殘基（ASP+Glu）和17個正電荷殘基（Arg+Lys）。總平均親水性為0.755，脂溶指數為118.31，不穩定指數為49.06，為不穩定蛋白。

2.5.2 MC4R基因編碼蛋白的疏水性/親水性預測和分析 MC4R基因編碼蛋白的親水性和疏水性分析運用ProtScale在線軟件進行。氨基酸親水性越強其分值越低，反之分值越高疏水性越強。圖2顯示，整個多肽鏈表現為疏水性。

2.5.3 MC4R基因編碼蛋白信號肽和跨膜區分析對MC4R基因編碼蛋白的信號肽分析，用SignalP3.0在線軟件進行分析，SignalP3.0主要是預測信號肽的切割位點及其分泌途徑，結果（圖3）表明該蛋白存在信號肽，發現在第1-22位氨基酸可能為信號肽，并且可能在第22和23位氨基酸之間發生切割。MC4R 基因編碼蛋白的跨膜結構經TMHMM2.0分析，結果（圖4）表明，編碼蛋白序列有7個跨膜區域，屬于跨膜轉運蛋白。

圖2 MC4R基因編碼蛋白疏水性分析

圖3 MC4R基因編碼氨基酸序列信號肽分析

圖4 MC4R基因編碼氨基酸序列跨膜區預測

2.5.4 MC4R基因編碼蛋白結構域和蛋白質功能位點預測 結構域是蛋白質亞基結構中明顯分開的緊密球狀結構區域，是蛋白序列結構和進化單元，具有一定生物學功能。通過InterPro對MC4R基因編碼蛋白的結構域預測，結果（圖5）顯示，該序列在第61-302位氨基酸之間屬于G蛋白偶聯受體超家族結構域，它具有7個結構域，分別位于氨基酸位點 64-70、79-100、129-151、165-186、193-216、243-267和284-310。通過NetPhos 2.0對蛋白質的磷酸化位點預測，結果表明，該蛋白含有10個磷酸化位點，分別位于第15、30、35、47、127、150、162、178、30和312位處。

2.5.5 MC4R基因編碼蛋白的高級結構 蛋白質的空間構象與功能有密切關系，生物體內蛋白質的合成、加工和成熟是一個復雜的過程，其中多肽鏈的正確折疊對其正確構象的形成和功能的發揮至關重要。因而預測及分析蛋白質的高級結構對了解其空間構象具有重要意義。MC4R基因編碼蛋白的 二級結構預測結果（圖6）表明，該蛋白由51.5%的α螺旋、1 6.27%的β折疊 和32.23%的無規則卷曲組成。可推斷MC4R基因編碼蛋白主要的二級結構元件是α螺旋和無規則卷曲。運用同源建模的方法，將MC4R基因編碼蛋白序列提交至SWISS-MODEL，該結果（圖7）與二級結構預測結果基本一致。

圖5 MC4R基因編碼蛋白的結構域預測

2.5.6 MC4R同源性比對 在各物種中MC4R基因具有高度的同源性，通過綿羊的MC4R基因與山羊（Capra hircus，NCBI登錄號：NM_001285591.1）、牛（Bos taurus，NCBI登錄號：EU366351.1）、野豬（Sus scrofa，NCBI登錄號：EU169096.1）、人類（Homo sapiens，NCBI登錄號：JX515605.1）及大猩猩（Gorilla gorilla，NCBI登錄號：FJ373054.1）進行同源性比對，結果表明，他們的相似性分別為97%、94%、81%、83%和83%。

圖6 MC4R基因編碼蛋白的二級結構預測

圖7 MC4R基因編碼蛋白質的三級結構預測模型

3 討論

綿羊MC4R基因有1 765 bp，含有998 bp的完整CDs，編碼332個氨基酸（GenBank登錄號：JQ710684.1），只有一個外顯子，編碼332個氨基酸（GenBank登錄號：AFJ95892.1）。近年來，國內外關于綿羊MC4R基因多態性的研究報道有第1232位點的G→A 的突變與綿羊背膘厚度間存在關聯，AG和AA 型較GG型具有較高的背膘厚度；第1 016位點的G→A轉換，湖羊基因型GG型，有較高的45 d斷奶體重［11］。本實驗發現3個綿羊群體均存在3種基因型，AB型個體在該基因編碼區第511位點發生G→A的突變，出現G/A的雜合，第495位發生C→T的突變，出現C/T雜合；AA型個體在該基因編碼區第511位點發生G→A的突變，出現AA的純合，第495位發生C→T的突變，出現CC純合。其中第495位的C→T轉換并沒有引起對應密碼子翻譯的氨基酸發生改變，由AGC變為AGT，均翻譯成Ser；第511位的C→T轉換后密碼子由GAA→AAA，翻譯的氨基酸由Glu轉換為Lys。MC4R基因編碼區第511位點的突變在不同綿羊群體中分布差異不顯著，但編碼的氨基酸不同，可能會引起黑素皮質素受體的構型不同，導致蛋白質的功能可能有所差異，作為控制綿羊生長性狀的潛在遺傳標記位點，還有待于進一步的實驗確認。

3個綿羊品種的優勢基因型均為BB型，優勢等位基因均為B基因。小尾寒羊多態信息含量處于0.25-0.5之間，屬于中度多態，甘肅肉用綿羊新品種群羊和湖羊屬于低度多態（PIC<0.25）；χ2適合性檢驗表明：除湖羊之外，其余2個綿羊品種均處于Hardy-Weinberg平衡狀態；這2個品種的綿羊已經形成了適應各自生存環境的遺傳特性，該突變位點在所在群體內能夠穩定遺傳。而湖羊的非Hardy-Weinberg平衡狀態，說明該地區自然選擇或者人工選擇對該基因分布的影響較大，造成其分布的不平衡，這可能與育種中的個體選擇有關。顯著性檢驗分析表明：該突變位點在3個品種綿羊相互之間分布差異不顯著。

生物信息學的預測對MC4R功能研究具有一定的指導意義。研究發現MC4R基因蛋白分子式為C1666H2621N413O456S26，其理論等電點為7.09，分子量為 3.047 2 kD，包含20種基本氨基酸，總肽鏈表現為疏水性，脂溶指數為118.31，流動性較強，不穩定指數為49.06，屬于跨膜轉運蛋白，這與張菊等［12］利用生物信息學方法，對MC4R編碼的蛋白進行功能預測結果一致。

綿羊的生長性狀是其重要的經濟性狀之一，國內外的大量研究表明，MC4R基因在動物體重、采食量和能量穩態的控制中具有重要作用，是一個調節能量平衡與能量動態平衡的重要信號分子，在人、豬和馬等哺乳動物中主要影響機體脂肪、增重和采食等性狀［13］。而綿羊的多態性突變也會影響到背膘厚和初生重、斷奶重等生長性狀，而本研究檢測到的位點在甘肅肉用綿羊新品種群羊、小尾寒羊和湖羊3個品種間沒有顯著性差異，若將該位點作為綿羊生長性狀相關突變位點研究還需擴大種群數量、品種種類并同生產性狀進行進一步的研究。

4 結論

MC4R在甘肅肉用綿羊新品種群羊、湖羊和小尾寒羊群體中均存在3種基因型AA型、AB型和BB型，2個多態性位點C495T、G511A；χ2適合性檢驗表明，甘肅肉用綿羊新品種群羊和小尾寒羊均處于Hardy-Weinberg平衡狀態；生物信息學分析表明綿羊MC4R是一個非常保守的蛋白，在綿羊的生長發育中起著重要作用。

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（責任編輯 狄艷紅）

Polymorphism and Bioinformatics Analysis of Gene MC4R in 3 Sheep Populations

LIU Jiao-jiao1，2MA You-ji1，2
（1. Faculty of Animal Science and Technology，Gansu Agriculture University，Lanzhou 730070；2. Gansu Engineering Laboratory of Sheep Breeding Biotechnology，Minqin 733300）

To investigate the molecular mechanism of Melanocortin-4 receptor（MC4R），PCR-SSCP was used to detect the polymorphism and analyze the bioinformatics of gene MC4R exon in 3 sheep populations（Gansu meat sheep new breeding population，Small Tail Han sheep，and Hu sheep）. The results showed that 3 genotypes of AA，AB and BB existed in 3 populations，and the dominant genotype was BB，the preponderant allele was B. The sequencing analysis indicated that comparing wild BB and mutated AB，G→A mutation in locus 511 and T→C mutation in locus 495 happened in AB；G→A mutation in locus 511 with AA homozygosity and T→C mutation in locus 495 with CC homozygosity happened in AA. The PIC of Small Tail Han sheep was moderately polymorphic（0.25 < PIC < 0.50），Gansu meat sheep new breeding population and Hu sheep belonged to low polymorphism（PIC < 0.25）. Except the Hu sheep，the other 2 sheep breeds were in Hardy-Weinberg equilibrium by χ2test. Bioinformatics analysis showed that the amino acid sequence of MC4R had hydrophobic region significantly，7 transmembrane helical regions and signal peptide. The main elements in the second structure of the encoded protein were the α helix and random coil. Homology analysis demonstrated that the similarity of gene MC4R in sheep with goat，cattle，pig，human，and gorilla was 97%，94%，81%，83% and 83% respectively，indicating that MC4R was an evolutionarily conserved protein，and played an important role in growth o f sheep.

sheep；gene MC4R；polymorphism；bioinformatics

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.011

2015-06-23

國家科技十二·五支撐計劃（2011BAD28B05），甘肅省農業生物技術研究與應用開發項目（GNSW-2012-19），甘肅省高校基本科研業務費（2014）

劉嬌嬌，女，碩士研究生，研究方向：動物生產學；E-mail：714643318@qq.com

馬友記，博士，教授，研究方向：羊生產系統與工程；E-mail：yjma@gsau.edu.cn