野生大豆根瘤GmGS1γ基因序列分析及原核表達

楊美英 岳勝天 韓紅 孫合美 劉晶晶 盧冬雪

（吉林農業大學生命科學院，長春 130118）

YANG Mei-ying YUE Sheng-tian HAN Hong SUN He-mei LIU Jing-jing LU Dong-xue

（College of Life Sciences，Jilin Agricultural University，Changchun 130118）

野生大豆根瘤GmGS1γ基因序列分析及原核表達

楊美英 岳勝天 韓紅 孫合美 劉晶晶 盧冬雪

（吉林農業大學生命科學院，長春 130118）

旨在明確大豆谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）基因家族各成員的結構特點及功能。利用同源克隆的方法從野生大豆根瘤克隆GmGS1γ基因。生物信息學分析表明，ORF為1 071 bp，與大豆GS1γ（AF363022.1）部分序列的相似性為100%，與序列號為X81700.1相似性為99%。該序列具備植物GS的兩個保守結構域，GS beta-Grasp功能區（17-97 aa）和GS催化功能區（103-350 aa）。系統發生樹表明該基因編碼的GS可能屬于胞質2型同工酶。該基因可以在大腸桿菌DE3.0中表達，蛋白分子量為44 kD。

野生大豆；谷氨酰胺合成酶（GS）；原核表達；序列分析

植物根系從土壤中吸收的NO3-，通過莖、葉柄運往葉片，在葉片中硝酸還原酶等的作用下轉化為氨態氮，再在谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）的作用下轉化為谷氨酰胺（Gln），進入氮代謝。除此以外，根瘤中向上運輸的酰脲在葉片中也代謝形成NH4+，經過GS 轉化后進入氮代謝［1］。因此，GS在植物氮代謝中起著關鍵的作用，是植株氮素轉化的關鍵酶［2］。

GS以多種形式存在于植物中，高等植物的種子、葉、根、根瘤和果實等器官中分布著多種GS的同工酶，GS的不同功能由不同的GS同工酶承擔［3］。在葉片中，GS2的功能是通過硝酸鹽還原和光呼吸過程來同化氨［4］；根中GS1直接從土壤中吸收氨或者NO3-［5］；胚中，吸收分解發芽期儲存的含氮物釋放的氨［6］；根瘤中GS主要是快速的吸收氮，固定細菌侵染的細胞排泄到植物中的氨［7］。GS 的分子生物學研究始于1983 年，從藍細菌克隆到GS 并完全測序分析。許多植物，如大麥［8］、水稻［9］、豌豆［10］等的GS cDNA已被克隆。

大豆作為一種重要的糧-油兼用作物，籽粒蛋白質含量明顯高于玉米、水稻等作物［11］，而且可以形成豆科植物-根瘤菌共生固氮體系。高蛋白野生大豆ZYD01251蛋白質含量可以達到53%以上，具有較強的氮素利用與貯藏機制。而且作者在前期的研究中發現高蛋白野生大豆根瘤衰老較慢，根瘤內氮代謝物含量豐富，生育后期仍具有較強的酰脲合成與運輸能力是形成該類型大豆籽粒高蛋白質含量的原因之一［12］。 為了進一步明確根瘤的生長發育及其基因表達對野生大豆蛋白質含量的影響，本研究從野生大豆根瘤中克隆GmGS1γ基因序列，對該序列利用生物信息學方法進行預測并構建pET-28a-GmGS1γ原核表達載體，在大腸桿菌中表達目的蛋白，旨在進一步認識野生大豆GS基因家族各成員的結構特點及其在氮素代謝過程中的功能，明確不同GS同工酶在植物氨同化過程中的貢獻以及為研究植物氮代謝機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒與試劑 大腸桿菌菌株DH5α、BL21（DE3）及載體pET28a（+）均為本實驗室保存。Easy ScriptTMFirst-strand cDNA Synthesis Super Mix反轉錄試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；限制性內切酶、Ex Taq酶、T4 DNA連接酶、DNA分子量標準、蛋白質分子量標準和pMD18-T載體試劑盒以及瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購于TaKaRa公司。其它試劑均為國產分析純。

1.1.2 植物材料 本實驗所用大豆材料為高蛋白野生大豆ZYD01251（原產于吉林省東遼縣，生育期125 d，蛋白含量53.0%）。

1.2 方法

1.2.1 根瘤樣品的采集及RNA的提取 將吉林農業大學大豆試驗田土壤裝入直徑為20 cm的塑料盆，種植野生大豆ZYD01251，每盆3株。收集45 d苗齡的大豆根瘤，用蒸餾水將根瘤沖洗干凈，快速用液氮處理后，-80℃冰箱保存。Trizol法提取大豆根瘤總RNA，752N紫外分光光度計測定OD260和OD280，選擇OD260/OD280介于1.7-2.0 的樣品，采用反轉錄試劑盒合成cDNA。1.2.2 GmGS1γ基因的PCR擴增 以野生大豆根瘤cDNA為模板，PCR擴增GmGS1γ基因。所用引物根據GenBank發表的大豆GmGS1γ序列（X81700.1）進行設計。GmGS1γF：5'-AAGAGTCTCCGCTGAAC -3'；GmGS1γR：5'-AACAGGCGAGGTAGTCA-3'。引物合成與擴增產物的序列測定均由上海生工生物工程有限公司完成。

將野生大豆GmGS1γ基因測序結果進行分析。采用GenBank DNA 數據庫進行BLAST同源性比較。采用NCBI在線軟件對GmGS1γ蛋白的結構域進行預測（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi）。搜索NCBI蛋白庫里所有大豆GS的全序列，利用DNAMAN軟件構建系統發生樹。

1.2.3 原核表達載體pET-28a-GmGS1γ的構建與鑒定 以測序為陽性的重組質粒pMD18-T-GmGS1γ為模板，兩端具有Xho I/Sal I酶切位點的引物GmGS1-γF：5'-CGAGCTCATGTCGTTACTCTCCGATCTTA-3'和GmGS1γR：5'-CCGCTCGAGCGTTGCTTATGGTTTCC AAAG-3'（下劃線部分為酶切位點）進行PCR，獲得兩端分別帶有Xho I和Sac I酶切位點的目的片段。將目的片段和pET28a（+）分別用Xho I和Sac I雙酶切，凝膠回收并連接。連接產物42℃熱激轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞。PCR及Xho I/Sac I雙酶切驗證為陽性的克隆送上海生工測序。

1.2.4 重組質粒pET-28a-GmGS1γ在大腸桿菌BL21（DE3）體內的誘導表達 將鑒定為陽性的BL21（pET-28a-GmGS1γ）挑取單菌落到LB液體培養基中（含Kan），37℃，160 r/min，過夜培養。以1%的接種量將過夜培養的菌液轉接到含有Kan抗性的 LB液體培養基中，37℃，160 r/min培養至OD600=0.6。加入IPTG使其終濃度為1.0 mmol/L，誘導2 h和4 h，各取1 mL菌液，10 000×g，離心10 min收集菌體。將收集到的菌體加入100 μL樣品溶解液充分混勻。100℃處理10 min，裂解菌體細胞。12 000 r/min離心10 min，收集上清，上樣20 μL，采用12%的分離膠和5%的濃縮膠進行SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達。

2 結果

2.1 根瘤總RNA的提取及GmGS1γ基因的克隆

為了克隆目的基因，從野生大豆的大豆根瘤中提取總RNA?？俁NA提取及GmGS1γ基因擴增結果（圖1）顯示，RNA提取效果理想，可以看到清晰的3條帶。提取的RNA可以進行下一步的RT-PCR實驗。以反轉錄后得到的cDNA為模板進行PCR擴增，在約1 000 bp處有一條清晰的特異性片段，大小與預測值相符。用DNA凝膠回收試劑盒將擴增出的片段進行回收，并將回收片段克隆到pMD18-T載體上，轉化E.coli JM109感受態細胞。

圖1 大豆根瘤總RNA提取及GmGS1γ基因克隆

2.2 GmGS1γ基因的序列分析

對構建成功的pMD18-T-GmGS1γ重組質粒中的目的片段進行測序。結果表明，序列全長1 215 bp。將該序列利用GenBank中BLAST進行分析，發現與大豆GS1γ（AF363022.1）部分序列的相似性為100%，與引物設計時選擇的GS參考序列（X81700.1）相似性為99%。利用NCBI的在線結構預測軟件對序列的結構域進行預測，結果（圖2）表明，這一序列包含一個1 071 bp編碼356 aa的ORF，為GS的編碼區，這個蛋白包含了一個GS beta-Grasp功能區（17-97 aa）和GS催化功能區（103-350 aa）。這些功能區在植物的GS中是保守的兩個結構域，從而證實GmGS1γ基因克隆成功。2.3 大豆各類GS蛋白全序列系統發生樹

從NCBI蛋白庫里共搜索到21條包括GS同工酶和GS受體蛋白的全序列，與GmGS1γ基因所編碼的蛋白序列，利用DNAMAN軟件進行系統發生樹的構建。結果（圖3）顯示，不同類的GS形成不同的簇。以胞質GS同工酶1型為主形成的第①簇，以GS前體為主形成的第②簇，而GmGS1γ基因序列所編碼的GS分在了第③簇中，并且與序列號為CAA57346（核酸序列為X81700）的谷氨酸氨連接酶及序列號為AAC97935的根瘤特異性GS相鄰，與序列號為XP_003519325的胞質GS 2型同工酶分成一個小的分支。

圖2 GmGS1γ基因編碼序列結構域及三維結構預測

2.4 原核表達載體pET-28a-GmGS1γ的構建

以重組質粒pMD18-T-GmGS1γ為模板，目的片段GmGS1γ基因ORF的擴增結果（圖4-A）顯示，大小約為1 000 bp。將該片段回收，限制性內切酶消化后，與pET-28a（+）進行連接獲得重組質粒pET-28-GmGS1γ，酶切結果如圖4-B所示。酶切獲得的片段與PCR擴增片段大小一致，說明重組質粒構建成功，可以進行下一步實驗。

圖3 大豆GS系統發生樹

圖4 GmGS1γ基因ORF的PCR（A）與酶切（B）結果

2.5 GmGS1γ基因在大腸桿菌中的誘導表達

將重組質粒pET-28-GmGS1γ轉化到表達菌BL21中，同時以原核表達質粒pET-28a（+）轉入表達菌BL21中作為對照。利用12%的SDS-PAGE對經1.0 mmol/L IPTG 誘導2 h和4 h的菌液進行分析。結果（圖5）顯示，兩個時間段的菌液均在約44.0 kD處明顯出現誘導表達的條帶，與預期結果一致，說明該基因在菌株BL21中成功表達，而且4 h時的表達量明顯高于2 h時的表達水平。

圖5GmGS1γ蛋白的表達

3 討論

根瘤中的根瘤菌（類菌體）利用宿主植物體提供的能量和內環境，將空氣中的N2還原為氨，供宿主植物利用，形成了自然界效率最高的共生固氮作用［13］。1988年米山忠克［14］研究認為，根瘤固氮首先在類菌體中將N2還原為NH4+，然后在GS的作用下合成Gln，再在一系列酶的作用下形成酰脲向地上部運輸。GS是高等植物氮素代謝的關鍵酶［15］。大豆GS1基因家族存在α、β、γ 3個組分［16，17］，其中子葉和幼根中以α為主；雖然β是組成型表達，但其卻在固氮根瘤中表達水平較高；γ1表現為根瘤特異表達［5］，而γ2則在根瘤、子葉和花中被檢測到［18］。王曉波等［19］研究發現，大豆根瘤中存在4個豆科植物特有的GS1基因。本研究從高蛋白野生大豆ZYD01251根瘤中成功克隆了GmGS1γ基因，BLAST結果顯示該基因序列與大豆GS1γ（AF363022.1）的相似性為100%。而且該序列編碼的氨基酸序列具有植物GS中保守的兩個結構域，GS beta-Grasp功能區和GS催化功能區，說明本實驗獲得的序列具有編碼大豆根瘤中GS的特征。而且從大豆GS系統發生樹分析，該基因編碼的氨基酸序列可能屬于胞質GS 2型同工酶。

高等植物中GS全酶均為八聚體，每個亞基分子量為38-45 kD［2］。本實驗中DE3.0（pET-28-GmGS1γ）表達的目的蛋白約為44 kD，該蛋白的大小符合GS亞基分子量的范圍。

4 結論

從野生大豆根瘤中克隆到ORF為1 071 bp的GmGS1γ序列，生物信息學分析表明，該序列具備植物GS的兩個保守結構域，GS beta-Grasp功能區（17-97 aa）和GS催化功能區（103-350 aa）。系統發生樹表明該基因編碼的GS可能屬于胞質2型同工酶。該基因可以在大腸桿菌DE3.0中表達，蛋白分子量為44 kD。

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（責任編輯 馬鑫）

Sequence Analysis and Prokaryotic Expression of GmGS1γ Gene from Nodules of Glycine soja

In order to clarify the structures and functions of the members of the glutamine synthetase（GS）gene family，the GmGS1 gene was cloned from Glycine soja by homologous cloning. The bioinformatics analysis showed that，the ORF was 1 071 bp，and the similarity was 100% and 99% with the partial sequence of soybean GS1γ（AF363022.1）and X81700.1，respectively. The sequence had two conserved domains of plant GS，beta-Grasp GS functional area（17-97 aa），and GS catalytic functional area（103-350 aa）. Phylogenetic tree showed that GS encoded by the gene GmGS1 probably belonged to glutamine synthetase cytosolic isozyme 2. The gene was expressed in Escherichia coli DE3.0，and the molecular weight of the protein was 44 kD.

Glycine soja；glutamine synthetase（GS）；prokaryotic expression；sequence analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.015

YANG Mei-ying YUE Sheng-tian HAN Hong SUN He-mei LIU Jing-jing LU Dong-xue

（College of Life Sciences，Jilin Agricultural University，Changchun 130118）

2015-07-07

國家自然科學基金項目（31201687）

楊美英，女，博士，副教授，研究方向：微生物的生化與分子生物學；E-mail：jlaumeiying@163.com