大腸桿菌氮代謝調節蛋白GlnG與固氮施氏假單胞菌氮代謝調節蛋白NtrC的功能互補研究

柯琪陳清華戰崳華陸偉燕永亮

（1.西南科技大學生命科學與工程學院，綿陽 621010；2.中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081）

大腸桿菌氮代謝調節蛋白GlnG與固氮施氏假單胞菌氮代謝調節蛋白NtrC的功能互補研究

柯琪1，2陳清華2戰崳華2陸偉2燕永亮2

（1.西南科技大學生命科學與工程學院，綿陽 621010；2.中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081）

旨在圍繞大腸桿菌DH10B（Escherichia coli DH10B）中氮代謝調節蛋白GlnG與施氏假單胞菌A1501（Pseudomonas stutzeri A1501）中氮代謝調節蛋白NtrC在一般氮代謝調控網絡中是否存在功能互補展開研究。利用DH10B菌的glnG基因回補A1501菌的ntrC突變株，以及A1501菌的ntrC基因回補DH10B菌的glnG突變株，對所獲得的功能互補株分別展開生理生化表型測定。結果表明，在以硝酸鉀或尿素為唯一氮源的培養條件下，DH10B glnG基因可以回補A1501 ntrC突變株的氮源利用能力，并且部分恢復ntrC突變株的固氮酶活性（約為野生型A1501固氮酶活性的45%）；與DH10B glnG突變株相比，A1501菌的ntrC基因回補了DH10B glnG突變株以精氨酸為唯一氮源的生長能力。以上結果說明DH10B菌的GlnG蛋白與A1501菌的NtrC蛋白不僅在進化關系上緊密聯系而且在所測試的氮代謝途徑中存在功能互補。

施氏假單胞菌A1501 NtrC；大腸桿菌DH10B GlnG；一般氮代謝；功能互補

生物固氮是微生物在某些特定的條件下將空氣中的氮氣還原為銨的過程［1］，是自然生態系統中氮的主要來源，在氮素的生態平衡和農、林生產業中發揮重要作用，而對于生物固氮調控過程的研究是目前微生物研究領域的熱點之一。

氮源是自然環境中影響生物固氮效率的一個重要的限制性因素，固氮微生物能否高效利用環境中的氮源，使生物固氮僅發生在有利和必要的條件下是關鍵性問題。目前已有研究表明在大腸桿菌（Escherichia coli）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、克雷伯氏菌（Klebsiella）和肺炎克氏桿菌（Klebsiella pneumoniae）中氮素吸收和氮源代謝由NtrBC（Nitrogen regulation，ntr）雙組份系統全局調控［2］。NtrBC雙組份系統（亦稱GlnLG雙組份系統）在革蘭氏陰性菌中廣泛存在，由組氨酸激酶NtrB和轉錄調控因子NtrC構成。在細菌所處生長環境缺乏氮源時，NtrB能夠自身磷酸化，并且發揮激酶作用將NtrC磷酸化，磷酸化以后的NtrC轉錄激活氮源轉運吸收和代謝相關基因的表達［3］。其中NtrC 蛋白（在固氮施氏假單胞菌A1501中由ntrC基因編碼）是固氮施氏假單胞菌A1501中固氮島基因表達激活的關鍵調節蛋白。在大腸桿菌中，GlnG蛋白（在DH10B菌中由glnG基因編碼）是氮限制條件下氮源選擇性同化途徑的全局激活子［4］。研究表明假單胞菌中的NtrC蛋白是激活一系列編碼參與氮源吸收和利用的蛋白基因表達所必需的因素［5］，包括自身操縱子glnA-ntrBC及atzDEF操縱子。同時NtrC在施氏假單胞菌中也參與固氮調控過程［6］，也有許多研究表明腸桿菌中的氮調節系統與假單胞菌很多相同之處［6，7］。大腸桿菌的代謝調控網絡目前研究較為透徹，具有可進行厭氧生長、易于培養以及遺傳操作方便等顯著優點。而作為第一株完成測序的聯合固氮菌，施氏假單胞菌A1501含有一全長49 kb的固氮島，含有59個編碼基因，其中傳統的20多個固氮相關基因是其實現生物固氮的遺傳基礎［8］。本實驗室已經成功將A1501的固氮島基因轉入大腸桿菌DH10B獲得了具有固氮酶活性的重組大腸桿菌，使得聯合固氮菌擺脫了遺傳背景不清楚的局限。然而重組大腸桿菌的固氮酶活性只有野生型A1501的1/10，因此，研究固氮條件下大腸桿菌內的氮代謝相關基因與施氏假單胞菌固氮島內相關基因的表達調控是否具有相關性，是提高重組大腸桿菌固氮能力的關鍵。

本研究通過構建DH10B glnG回補A1501 ntrC突變株的功能互補株和A1501 ntrC回補DH10B glnG突變株的功能互補株，對突變株和功能互補株在唯一氮源條件下生長能力進行分析，旨在為揭示DH10B GlnG與A1501 NtrC兩蛋白在細菌一般氮代謝過程中是否具有調控功能的相關性奠定理論基礎，也為進一步提高重組菌固氮酶活性提供理論依據。

1 材料與方法

表1 實驗所用菌株

1.1 材料

1.1.1 本研究中所涉及的細菌菌株主要是固氮施氏假單胞菌野生型及相關突變株和互補株（表1）。

1.1.2 培養基及生化試劑 LB培養基（固體培養基含1.5%瓊脂粉）：0.5%酵母提取物，1.0%胰蛋白胨，1.0%氯化鈉，pH7.0。改良K培養基（固體培養 基 含1.5%瓊 脂 粉 ）：0.04% KH2PO4，0.01%K2HPO4，0.01% NaCl，0.02% MgSO4·7H2O，0.001% MnSO4·H2O，0.001% Fe2（SO4）3·H2O，0.001% Na2MoO4·H2O，0.6% C3H5NaO3，0.04%（NH4）2SO4，pH6.8 。M9培養基（固體培養基含1.5%瓊脂粉）：20% 5×M9鹽溶液，0.2% 1 mol/L MgSO4，20%葡萄糖，0.01% 1 mol/L CaCl2。5×M9鹽溶液：6.4% Na2HPO4，1.5% KH2PO4，0.25% NaCl，0.5% NH4Cl。1.1.3 引物合成和測序 由北京擎科生物技術有限公司及六合華大基因有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 三親結合實驗 活化供體菌（大腸桿菌JM109）、受體菌（A1501）以及含有助質粒pRK2013的大腸桿菌，轉接至相應液體培養基中。過夜培養后接至新鮮的液體培養基中，30℃，220 r/min蕩培養至OD600=0.6-0.8。吸取1.5 mL液離心收集菌體沉淀。用0.85%的生理鹽水洗滌菌體2次，并將3管相同的菌液合為一管，離心收集菌體沉淀后加入100 μL 0.85%的生理鹽水將3種菌液稀釋成同一濃度，按供體菌∶受體菌∶助質粒為2∶2∶1的比例將3種混合均勻離心收集菌體沉淀。用50-100 μL 0.85%的生理鹽水重懸菌體并點于LB（無任何抗性）平板中央，風干后放于30℃培養箱。培養24-48 h后將所有菌苔刮下，用0.85%的生理鹽水倍比稀釋各取100 μL涂在加相應抗生素的K培養基平板上，30℃培養至單菌落長到合適大小。

1.2.2 以10 mmol/L硝酸鉀和10 mmol/L尿素為唯一氮源條件下的生長曲線測定 活化菌株A1501、ΔntrC、ntrC-comp、glnG-comp，接種至新鮮的K培養基中，30℃過夜培養，離心收集菌體沉淀。用0.85%的生理鹽水洗滌菌體2次。用以10 mmol/L硝酸鉀和10 mmol/L尿素為唯一氮源的液體培養基重懸菌體，并調節菌液初始OD600為1.0。將2 mL菌液接種于18 mL以10 mmol/L硝酸鉀和10 mmol/L尿素為唯一氮源的液體培養基，30℃，220 r/min震蕩培養，每個體系3個重復。分別于2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24 h取樣，測定各菌液的OD600。

1.2.3 施氏假單胞菌固氮酶活測定 活化菌株A1501、ΔntrC、ntrC-comp、glnG-comp，接種至新鮮無氮培養基中，30℃過夜培養，離心收集菌體沉淀。用0.85%的生理鹽水洗滌菌體2次。用液體無氮培養基K重懸菌體，并調節菌液初始OD600為1.0。將1 mL菌液接種于9 mL無氮K培養基中，封口后每瓶充5 min氬氣并注入0.5%的氧氣和10%的乙炔，30℃，220 r/min震蕩培養，每個體系3個重復。分別于4、6、8、10 h取樣250 μL氣體進行氣譜檢測，并記錄乙烯的峰面積。

利用公式 固氮酶活=乙烯峰面積×（搖瓶中氣相總體積/進樣量）/（1 nmol標準乙烯峰面積×反應時間×蛋白量）計算固氮酶活性。其中搖瓶中氣相總體積為70 mL，1 nmol標準乙烯峰面積為1 962.9，蛋白量為0.68 mg。

1.2.4 以精氨酸為唯一氮源條件下的生長曲線測定 活化菌株DH10B、ΔglnG、ntrC-comp-E，接種至液體培養基M9中，37℃過夜培養。離心收集菌體。用0.85% 的生理鹽水洗滌菌體2次。用以精氨酸為唯一氮源的液體培養基重懸菌體，并調節菌液初始OD600為1.0。接種200 μL菌液于19.8 mL以精氨酸為唯一氮源的液體培養基，37℃，220 r/min震蕩培養，每個體系3個重復。分別于2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24 h取樣，測定各菌液的OD600。

1.2.5 引物設計 根據NCBI數據庫的GenBank中獲得大腸桿菌DH10B及施氏假單胞菌A1501的基因組序列后分別找到目標基因glnG和ntrC，用Primer premier 5.0設 計 引 物glnG（F）/glnG（R）和 ntrC（F）/ntrC（R）。glnG（F）：5'-CAAAGCTT CCACTCGATACCAGATTA-3'和 glnG（R）5'-CGGGATCC AGGAAATAAAGGTGACG-3'，下劃線分別為Hind III和BamH I酶切位點。ntrC（F）：5'-TTTAAGCTTTGTCGCAGGTCGGAT-3'，和ntrC（R）：5'-TTGGATCCAGAACATCATCAGTCAG-3'，下劃線分別為Hind III和BamH I酶切位點。以基因組DNA為模板用引物glnG（F）/glnG（R）和ntrC（F）/ntrC（R）擴增glnG和ntrC基因片段。PCR擴增條件：95℃10 min；95℃ 30 s，54-62℃ 1.5 min，72℃ 30 s，30個循環；72℃ 10 min。

2 結果

2.1DH10B GlnG和A1501 NtrC的生物信息學及理化性質分析

在 NCBI數 據 庫 中（http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi）分別檢索DH10B GlnG及A1501 NtrC兩蛋白質的氨基酸序列，獲得序列后利用DNAMAN軟件對兩個序列進行序列比對分析，比對結果（圖1）顯示兩個蛋白的一級結構相似，氨基酸序列相似性為63.5%。

圖1 DH10B GlnG與A1501 NtrC蛋白質氨基酸序列比對

利用 ExPASy（Expert Protein Analysis System）數據庫中進行氨基酸理化參數計算的工具ProtParam（http://expasy.org/tools/protparam.html）對兩個蛋白質進行了比較分析。結果（表2）顯示兩個蛋白的分子量、等電點等都非常接近。以上結果表明DH10B GlnG蛋白與A1501 NtrC蛋白在結構上具有一定相似性，兩蛋白可能具有功能相關性。

表2 A1501 NtrC與DH10B GlnG理化性質比較（預測）

2.2 glnG互補ΔntrC功能互補株的構建及表型分析

本實驗室已經采用廣宿質粒pLAFR3通過雙酶切成功構建了pLAFR3-glnG重組質粒，本研究通過三親結合的方法將重組質粒 pLAFR3-glnG導入ΔntrC中。在含有四環素（Tc）和氯霉素（Cm）雙抗性的固體限制性培養基K上進行陽性克隆篩選，再利用引物glnG（F）/glnG（R）進行菌落PCR驗證（圖2），得到glnG互補ΔntrC的功能互補株（glnG-comp）。

圖2 菌落PCR驗證glnG基因

為了研究GlnG能否替代NtrC在ΔntrC一般氮代謝過程中行使功能，我們構建了glnG互補ΔntrC的功能互補株并進行了相應功能表型測定。因本實驗室已經證實ΔntrC不能在以硝酸鉀或尿素為唯一氮源的培養基上生長，所以本研究測定了A1501、A1501ΔntrC、ntrC-comp以及glnG-comp在培養基K中以硝酸鉀和尿素為唯一氮源的生長曲線（圖3）。從圖中可以看到ΔntrC能夠利用硝酸鉀和尿素為唯一氮源進行生長，野生型A1501在該條件下生長良好。而不論是用ntrC還是用glnG回補ΔntrC都能使其恢復一定的生長能力。結果表明，glnG已在ΔntrC中成功表達，并能夠替代ntrC實現對硝酸鉀和尿素功能的利用，這一結果表明GlnG蛋白與NtrC蛋白在氮代謝過程中具有功能相關性。

圖3 四種菌株在以10 mmol/L硝酸鉀（A）及10 mmol/L尿素（B）為唯一氮源條件下的生長曲線

為了進一步驗證 GlnG蛋白與NtrC蛋白在固氮調控過程中是否具有功能相關性，我們對A1501、ΔntrC、ntrC-comp及glnG-comp的固氮酶活性進行了測定。結果（圖4）發現ntrC突變以后使菌株的固氮酶活性基本喪失，而glnG-comp具有一定的固氮酶活性，約為野生型A1501的45%。說明在固氮過程中，glnG能夠部分互補ntrC的調節功能，使菌株表現出固氮酶活性。結果表明，在重組大腸桿菌中GlnG參與了固氮表達調控，與NtrC蛋白具有功能相關性。

圖4 四種菌株固氮酶活性的測定

2.3 ntrC互補ΔglnG功能互補株的構建及表型分析

本實驗室已成功地將A1501ntrC片段克隆到廣宿主質粒載體pLAFR3上，構建了A1501 NtrC蛋白的表達載體 pLAFR3-ntrC。本研究首先提取了重組質粒 pLAFR3-ntrC，然后通過電擊轉化將重組質粒pLAFR3-ntrC導入到ΔglnG中，再利用含有四環素（Tc）和卡那霉素（Km）雙抗性的固體LB平板進行陽性克隆篩選。最后利用ntrC（F）/ntrC（R）引物進行菌落PCR驗證（圖5），得到ntrC回補ΔglnG的功能互補株（ntrC-comp-E）。

圖5 菌落PCR驗證ntrC基因

為了研究NtrC蛋白能否在 E.coli DH10B中代替GlnG在一般氮代謝過程中行使功能，我們對ΔglnG和ntrC-comp-E進行了相應表型測定。因為有研究表明ΔglnG不能在以精氨酸為唯一氮源的條件下進行生長［9］，所以本研究測定了E.coli DH10B、ΔglnG以及ntrC-comp-E在培養基M9中以精氨酸為唯一氮源條件下的生長曲線。結果（圖6）顯示 ΔglnG在M9培養基中不能夠以精氨酸為唯一氮源進行生長，野生型E.coli DH10B在該條件下生長良好。而當用ntrC互補ΔglnG突變株時，功能互補菌株基本恢復了生長能力。結果表明，ntrC已在ΔglnG中成功表達，并能夠替代glnG在E.coli DH10B菌的一般氮代謝過程中行使功能，實現對精氨酸利用功能的互補。

圖6 三種菌株在以精氨酸為唯一氮源條件下的生長曲線

3 討論

氮調節是涉及多個信號轉導和效應蛋白的復雜調控網絡，該領域在腸道菌中已經進行了深層研究。假單胞菌的氮代謝系統與腸細菌相比有很多共同特點，均含有典型的氮代謝調節系統即NRII-NRI雙組分調節系統［3］，該系統由尿苷轉移酶（GlnD）、PII（GlnB、GlnK）、NRII（GlnL/NtrB）和 NRI（GlnG/NtrC）等具有雙功能的蛋白組成。然而，施氏假單胞菌的氮調節與大腸桿菌也有很多不同之處。首先，施氏假單胞菌中Ntr系統的功能僅由glnK基因編碼的PII蛋白調控，其產物直接編碼高親和力轉運蛋白的amtB基因相互作用。而在大腸桿菌中，glnB和glnK都編碼PII蛋白，其中組成型表達的GlnB蛋白由glnB編碼，由于GlnK的轉錄依賴于NRI，因此glnK編碼的GlnK蛋白只在低氮條件下表達，GlnB和 GlnK的功能也部分重疊［10］。

Schumacher等［5］研究表明，NRI（NtrC）的存在導致惡臭假單胞菌中glnK和amtB的表達受氮源調控，其功能僅在氮限制的條件下由NtrC激活［5］。體外純化蛋白實驗表明，glnK的轉錄直接被 NtrC激活［5］。通過對施氏假單胞菌A1501中glnK基因的序列分析，發現在glnK基因的啟動子上游-12/-24處具有與σ54結合位點相似的序列。在低氮的條件下，依賴于σ54的啟動區開始轉錄后glnK 基因開始表達，該表達受NtrC蛋白調控；在高氮條件下，glnK基因可能在一個不依賴于σ54和NtrC蛋白調控的啟動子區開始轉錄并進行低水平表達［11］。

在大腸桿菌中，glnK基因上游區域也含有一個 σ54結合位點，一個 NRI（GlnG）結合位點，操縱子表達也依賴GlnG同時也受到氮素調控［12，13］。另外，與大腸桿菌glnKp不同的是惡臭假單胞菌glnKp開放復合物的形成強烈依賴于IHF，這在體內才能觀察到。并且IHF的參與，加上其螺旋的同一側存在兩個連續的NtrC結合位點，表明惡臭假單胞菌glnKp的轉錄激活對低濃度的NtrC是敏感的。這兩個不同點可能與缺乏組成型GlnB蛋白進行高效氮抑制有關［14］。其次，大腸桿菌氮調節的操縱子也包含能被 σ70RNA聚合酶全酶識別的啟動子［15］，這些操縱子的轉錄受到氮同化控制蛋白（Nac）-LysR 型調節子的調控。在大腸桿菌中受Nac激活的基因和操縱子涉及氮化分子的轉運［16］，這也可能作為氮的來源。然而施氏假單胞菌A1501全基因組數據表明其不含有nac基因［17］，并且已測序的假單胞菌基因組表明該屬菌中不含有Nac同源物［18］。有研究證實在惡臭假單胞菌中，由NtrC直接激活的基因同時含有σ54依賴型啟動子和Nac激活基因同源物，這避免了需要一個適配器來共同調節σ54和σ70依賴型基因［19］。進而推測通過Nac介導的依賴σ70的級聯氮調控不是腸桿菌所必須的，因為許多菌中不含有nac基因。在沙門氏菌中，最近發現似乎Nac也丟失了，因為在響應氮的情況下它不能控制依賴σ70基因的表達。然而沙門氏菌中hutC基因的啟動子仍易受克雷伯氏菌Nac的激活［20，21］。相反在惡臭假單胞菌中，這些基因有的仍然響應氮的調控，但是它們的啟動子依賴σ54，直接受到NtrC的調控，從而避免了額外的調控［22］。由此可知施氏假單胞菌A1501中由氮介導的調控網絡也是大腸桿菌中氮調控網絡的簡化模式：只含有一個PII蛋白，沒有Nac參與的級聯調控［23］，這可能是造成DH10B GlnG和A1501 NtrC調控功能差異的因素。

本研究證實了DH10B GlnG和A1501 NtrC蛋白在一級結構、理化性質以及功能上都具有很大的相似性。這些數據表明，在大腸桿菌和施氏假單孢菌中的NRI蛋白的功能是高度保守的，兩個蛋白可以進行相互替換。同時也發現，DH10B glnG互補A150 ntrC突變株時，在一般氮代謝方面的功能互補性高于調控固氮過程的功能互補性，推測這可能與大腸桿菌和施氏假單胞菌中氮介導的調節網絡的不同有關，也可能是在進化過程中，由于大腸桿菌所處的環境營養條件優越，造成其一般氮代謝調節蛋白GlnG在功能上產生了分化。

4 結論

本研究成功構建了DH10B glnG回補A1501 ΔntrC的功能互補株和A1501ntrC回補DH10B ΔglnG的功能互補株，并對互補株和突變株與野生型的氮源利用和生物固氮能力等方面進行了比較分析，結果顯示DH10B glnG能夠互補A1501 ntrC在氮源利用和氮限制條件下的調節功能，而A1501 ntrC能夠互補DH10B glnG在氮源條件下的生長能力，這一結果表明DH10B菌中的GlnG可能通過互補A1501菌中 NtrC蛋白在氮限制條件下的調節功能進而參與到一般氮代謝調控網絡過程中。

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（責任編輯 馬鑫）

Functional Complement Between General Nitrogen Regulator GlnG in Escherichia coli and General Nitrogen Regulator NtrC in Pseudomonas

KE Qi1，2CHEN Qing-hua2ZHAN Yu-hua2LU Wei2YAN Yong-liang2
（1. School of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010；2. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

This study aims to investigate whether or not there is functional complement in general nitrogen-regulation network between nitrogen metabolism regulator GlnG from Escherichia coli DH10B and NtrC from Pseudomonas stutzeri A1501. Using gene glnG of DH10B to complement gene ntrC of A1501 or vice versa，the physiological and biochemical phenotypes of the obtained functionally complementary strains were measured. The results showed that while nitrate or urea as the sole nitrogen source，DH10B’s glnG complemented the nitrogenutilizing ability and partially restored the nitrogenase activity（about 45% of wild type）of mutant A1501’s ntrC. Comparing with DH10B’s glnG，A1501’s ntrC only complemented mutant DH10B glnG while arginine as sole nitrogen source. Above results revealed that not only was there close phylogenetical relationship，but also the functional complement in the tested nitrogen metabolism between DH10B’s GlnG and A1501’s NtrC.

Pseudomonas stutzeri A1501 NtrC；Escherichia coli DH10B GlnG；general nitrogen metabolism；functional complement

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.025

2015-12-17

國家“973”項目（2015CB755700），國家自然科學基金項目（31470174），廣東省引進創新創業團隊計劃項目（2013S033）

柯琪，女，碩士，研究方向：固氮微生物與基因工程，E-mail：543274382@qq.com；陳清華為本文并列第一作者

燕永亮，博士，副研究員，碩士生導師，研究方向：固氮微生物分子生物學及基因工程；E-mail：yanyongliang@caas.cn